第一部分BRG1及相关蛋白在胸主动脉夹层中的表达目的：包含BRG1的染色质重塑复合物在心血管系统的作用已经被多项研究所证实。相关研究证明染色质重塑酶BRG1参与了基质金属蛋白酶-9/-2的表达调控，并在血管平滑肌细胞的表型转换及细胞增殖和凋亡等进程中发挥重要作用。平滑肌细胞作为主动脉中层的主要细胞成分是细胞外基质成分的主要分泌来源，其表型转换及凋亡和增殖平衡的失调参与了胸主动脉夹层的发病和进展过程。本部分研究BRG1基因及其编码蛋白、人主动脉平滑肌细胞表型转换相关蛋白和基质金属蛋白酶-9/-2在胸主动脉夹层患者主动脉中层组织中的表达情况，检测主动脉平滑肌细胞在胸主动脉夹层中的凋亡。并分析胸主动脉夹层组织中BRG1表达水平与基质金属蛋白酶-9/-2表达量、平滑肌细胞表型转换及细胞凋亡的相关性。方法：实验分为两组，胸主动脉夹层组为20例接受手术的胸主动脉夹层患者主动脉中层组织，对照组为10例正常捐献者主动脉中层组织。分别采用实时荧光定量qRT-PCR和蛋白免疫印迹（Western blot）法检测两组主动脉中层组织中BRG1mRNA及其编码蛋白的表达水平；应用免疫组织化学方法分析BRG1、基质金属蛋白酶-9/-2蛋白表达和α-SMA阳性平滑肌细胞比例在两组间的差异。应用TUNEL法检测两组主动脉平滑肌细胞凋亡率。并分析胸主动脉夹层组织中BRG1表达量与基质金属蛋白酶-9/-2表达水平、α-SMA阳性平滑肌细胞比例及细胞凋亡的相关性。结果：实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测结果提示，与正常对照组相比，胸主动脉夹层组主动脉中层组织中BRG1mRNA（3.18±0.74vs1.25±0.23，P<0.01）和蛋白（0.66±0.05vs0.34±0.05，P<0.01）表达水平显著升高；免疫组织化学结果提示，BRG1主要表达于主动脉中层平滑肌细胞核内，胸主动脉夹层组平均累计光密度值较对照组显著升高（577.88±41.27vs264.00±25.50，P<0.01）。胸主动脉夹层组基质金属蛋白酶-2/-9蛋白表达水平较正常对照组显著升高（P均<0.05），且在胸主动脉夹层组织中BRG1的表达量与基质金属蛋白酶-2/-9表达水平呈显著正相关(r=0.479,P=0.007和r=0.418, P=0.022)；在胸主动脉夹层组主动脉中层组织中α-SMA阳性平滑肌细胞比例显著少于正常对照组(P<0.05)，且BRG1蛋白表达量与α-SMA阳性平滑肌细胞比例呈显著负相关(r=﹣0.403，P=0.027)。 TUNEL法检测主动脉壁中层组织中的平滑肌细胞凋亡率，结果显示夹层组的细胞凋亡率显著增加（25.52±4.87vs2.54±1.48，P<0.01）。并且在胸主动脉夹层主动脉中层组织中，BRG1的表达量与人主动脉平滑肌细胞凋亡率呈显著正相关（r=0.408，P=0.025）。结论：BRG1mRNA及其编码蛋白在胸主动脉夹层患者主动脉中层组织中表达显著升高，且BRG1蛋白表达水平与基质金属蛋白酶-9/-2表达量及血管平滑肌细胞凋亡率呈显著正相关，而与α-SMA阳性平滑肌细胞比例呈显著负相关，提示BRG1可能通过调控基质金属蛋白酶-2/-9表达水平和血管平滑肌细胞的凋亡与表型转化并进而在胸主动脉夹层的发病过程中发挥重要作用。第二部分BRG1过表达对主动脉平滑肌细胞生物学属性的影响目的：我们通过实验证明BRG1mRNA及其编码蛋白的表达水平在胸主动脉夹层中显著升高，提示其可能在胸主动脉夹层的发生和进展过程中发挥重要作用。人主动脉平滑肌细胞是主动脉中层的主要细胞成分，也是细胞外基质的主要来源，并参与了胸主动脉夹层的病理过程。为了进一步阐释BRG1在胸主动脉夹层中的作用，我们拟通过过表达BRG1的重组腺病毒（Ad.BRG1）转染人主动脉平滑肌细胞，并观察BRG1增强表达对人主动脉平滑肌细胞基质金属蛋白酶-9/-2和α-SMA表达水平的影响，并观察人主动脉平滑肌细胞凋亡和表型转化的变化，探讨其在胸主动脉夹层病理生理过程中的作用。方法：通过重组腺病毒转染的方法在人主动脉平滑肌细胞中过表达BRG1基因。细胞转染后应用实时荧光定量RT-PCR和Western blot鉴定BRG1转染效率，并检测BRG1基因过表达后人主动脉平滑肌细胞中基质金属蛋白酶-9/-2和α-SMA mRNA和蛋白的表达水平；应用流式细胞术检测人主动脉平滑肌细胞凋亡率和α-SMA阳性平滑肌细胞率。结果：腺病毒转染人主动脉平滑肌细胞后，Ad.BRG1转染组BRG1mRNA（0.61±0.12）和蛋白（0.42±0.05）表达水平显著高于对照组（Ad.Null组）（0.13±0.02和0.18±0.04），差异有显著统计学意义（均为P＜0.01）。Ad.BRG1和Ad.Null分别转染人主动脉平滑肌细胞72小时后，通过annexin V-FITC/PI染色及流式细胞术检测发现：Ad.BRG1组主动脉平滑肌细胞凋亡率显著高于Ad.Null组（17.25±2.23vs8.26±2.14，P＜0.01）。实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测提示在重组腺病毒转染组基质金属蛋白酶-2mRNA和蛋白的表达水平显著高于对照组（分别为0.22±0.02vs0.12±0.01和0.19±0.03vs0.13±0.02，P均<0.01）。基质金属蛋白酶-9mRNA和蛋白表达水平也显著高于对照组（分别为0.11±0.01vs0.02±0.01和0.10±0.01vs0.04±0.01，P均<0.01）。与Ad.Null组相比，Ad.BRG1组人主动脉平滑肌细胞中α-SMAmRNA（0.36±0.05vs0.57±0.12，P <0.01）和蛋白表达水平（0.32±0.08vs0.43±0.06，P<0.05）均显著降低。流式细胞术检测结果提示Ad.BRG1转染组人主动脉平滑肌细胞的α-SMA阳性率较Ad.Null组显著降低（33.52±3.56vs43.68±0.3.28，P <0.01）。结论：针对BRG1的过表达腺病毒质粒成功转染人主动脉平滑肌细胞系。腺病毒转染后，BRG1mRNA和蛋白均显著增高表达。BRG1过表达能够促进人主动脉平滑肌细胞凋亡和人主动脉平滑肌细胞由收缩型至合成型表型的转换，并显著提高基质金属蛋白酶-9/-2mRNA和蛋白的表达水平。这些结果均提示BRG1可能参与了人主动脉平滑肌细胞的病理生理过程。并可能在胸主动脉夹层的发展过程中发挥关键作用。第三部分人BRG1基因慢病毒载体构建及主动脉平滑肌细胞RNAi效率验证目的：BRG1过表达实验提示其可能参与了人主动脉平滑肌细胞的病理生理过程，为了进一步研究BRG1在人主动脉平滑肌细胞中的作用机制，我们通过构建人BRG1基因的shRNA慢病毒载体并验证其人主动脉平滑肌细胞中的沉默效率。以期为后续实验提供可靠的实验工具和基础。方法：设计三个针对人BRG1基因的特异性siRNA靶点，构建于pLKO.1慢病毒载体，并与psPAX2和pMD2.G共同转染293T细胞以包装成慢病毒颗粒。将包装后的慢病毒质粒感染人主动脉平滑肌细胞后应用实时荧光定量RT-PCR和westernblot方法检测BRG1mRNA和蛋白表达水平，并判断其沉默效率。结果：构建的慢病毒载体BRG1shRNA测序正确，三种BRG1-shRNA干扰序列均成功插入慢病毒载体质粒中。三种慢病毒pLKO.1-BRG1-shRNA干扰载体均可有效降低主动脉平滑肌细胞BRG1mRNA表达水平（P均＜0.01）。其中BRG1shRNA-3的沉默效率最高（88.8%）。慢病毒BRG1shRNA-3转染主动脉平滑肌细胞后BRG1蛋白表达水平较阴性对照组显著下降（0.11±0.01vs0.56±0.01，P＜0.01）。结论：成功构建了针对人BRG1基因的RNAi慢病毒表达载体，慢病毒BRG1shRNA-3能够有效抑制人主动脉平滑肌细胞BRG1mRNA和蛋白表达水平，为今后探讨BRG1在人主动脉平滑肌细胞的病理生理过程中的作用奠定了基础。第四部分BRG1相关长链非编码RNA对主动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响目的：主动脉中层人主动脉平滑肌细胞的凋亡增加被认为是胸主动脉夹层发生和进展的重要因素。我们的实验证明过表达BRG1基因能够促进人主动脉平滑肌细胞的凋亡，但是其具体机制和作用途径目前仍不明确。越来越多的证据表明长链非编码RNA在细胞增殖和凋亡等多种细胞进程中发挥重要作用。相关的研究也证实长链非编码RNA同样受到表观遗传进程的调控。然而，目前却鲜见关于长链非编码RNA与包含BRG1的染色质重塑复合物之间相互作用方式的研究。因此我们在人主动脉平滑肌细胞中应用长链非编码RNART-PCRArray方法，筛选染色质重塑酶BRG1调控的长链非编码RNA，并进一步探讨该长链非编码RNA对人主动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法：应用构建成功的BRG1shRNA慢病毒和BRG1过表达腺病毒分别转染人主动脉平滑肌细胞，使用长链非编码RNA的RT-PCR（反转录-聚合酶链反应）Array方法，检测相关长链非编码RNA的差异表达，并筛选出BRG1调控的长链非编码RNA。使用shHIF1A-AS1干扰质粒转染人主动脉平滑肌细胞，并应用qRT-PCR检测长链非编码RNAHIF1A-AS1的干扰效率。ShHIF1A-AS1质粒转染人主动脉平滑肌细胞后，应用Caspase3酶活性检测法、Western blot和CCK8细胞增值检测方法分别检测HIF1A-AS1干扰表达后对人主动脉平滑肌细胞caspase3酶活性、凋亡相关蛋白caspase3和Bcl2的表达水平和细胞增殖水平的影响。结果：长链非编码RNA RT-PCR Array结果提示，在所有被检测的长链非编码RNA表达差异的结果中，HIF1A-AS1的变化最为明显。进一步通过细胞验证结果提示，在平滑肌细胞中BRG1过表达和干扰表达后，长链非编码RNAHIF1A-AS1的表达水平分别为对照组的3.13倍和0.27倍（P均<0.05）。ShHIF1A-AS1质粒转染人主动脉平滑肌细胞后，shHIF1A-AS1转染组HIF1A-AS1表达水平较阴性对照组显著下降（0.29±0.02vs1.0±0.10，P＜0.01），干扰效率约为71.0%。ShHIF1A-AS1转染人主动脉平滑肌细胞后，shHIF1A-AS1转染组caspase3蛋白表达水平显著降低，为scramble对照组的0.7倍，而Bcl-2蛋白表达水平显著升高，为scramble对照组的1.3倍（P均＜0.05）。质粒转染72小时后Caspase-3活性检测结果提示，shHIF1A-AS1质粒转染组A=405nm处吸光度值显著低于scramble对照组（836.0±98.5vs1371.3±102.6，P＜0.05）。CCK8细胞增殖检测结果提示，ShHIF1A-AS1质粒转染组细胞溶液在第2、第3和第4天的A=450nm处的吸光度值均显著高于scramble质粒转染组。分别为：第2天(0.31±0.01vs0.22±0.01)，第3天(0.51±0.07vs0.30±0.02)和第4天(0.60±0.04vs0.45±0.02)，P均<0.05。结论： BRG1能够正向调控长链非编码RNAHIF1A-AS1的表达水平。在人主动脉平滑肌细胞系干扰HIF1A-AS1表达能够显著抑制细胞凋亡并促进增殖。虽然BRG1和HIF1A-AS1之间精确的调控关系还仍需进一步的探究，但是主动脉平滑肌细胞凋亡和增殖之间精确的平衡对于正常主动脉来说是异常重要的，而BRG1和HIF1A-AS1可能在这一动态平衡中发挥着至关重要的作用。