硫化氢(H2S)作为一种重要的气体递质分子,在生命活动中扮演着无可取代的角色。生物体内的H2S主要由胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)催化底物L-半胱氨酸产生,当CBS/CSE的活性发生改变,会严重影响H2S的生理浓度,进而诱发各类疾病。因此,精确掌握H2S的含量变化以及引起H2S浓度改变的生理机制显得愈发重要。这不仅要求研究者准确追踪H2S生理浓度的变化,而且对引起H2S浓度改变的CBS/CSE活性的实时监测,成为了科学工作者亟需解决的科学难题。化学工作者近年来发展了一大批荧光分子探针用于监测生物体内H2S的浓度变化,但大多数H2S探针是基于单光子检测手段,对复杂生物体内H2S的研究还存在一些困难。虽然一些已报道的H2S双光子探针能够很好地应用于生物体内的成像分析,但是大部分H2S探针的响应时间需要30 min以上,不利于体内快速代谢的H2S的检测。另外,由于H2S的浓度与CBS/CSE的活性具有明显的相关性,发展检测CBS/CSE的活性探针对进一步了解H2S的生理机制具有重要的价值。但是,目前检测CBS/CSE的方法主要集中在同位素标记法、比色法以及分光光度法,但是,这些方法存在一些固有缺陷,比如操作繁琐、程序复杂以及灵敏度低等,而且仅适用于体外检测,无法实现实时、无损、原位分析。因此,寻找一种能实现对生物体内CBS/CSE活性实时、无损检测的手段是非常重要的。针对H2S的研究现状,且基于双光子荧光成像具有分辨率高、组织穿透性好等优势,本文具体开展了以下两个工作:(1)基于香豆素衍生物较强的双光子吸收面积,本工作发展了一种新型的双光子荧光探针TPP-H2S。为了提高TPP-H2S与H2S的反应速率,引入了 NBD-C1基团。NBD-C1具有很强的拉电子效应,使得连接基团O带部分正电荷,这为H2S的进攻,提供了一个良好的亲核位点。利用H2S较强的亲核能力,TPP-H2S与H2S能够快速地发生亲核取代反应,整个反应过程仅需2min左右。此外,NBD-C1与香豆素存在较好的分子内电荷转移效应,TPP-H2S的荧光被淬灭,当醚键被H2S切断,羟基被释放出来,香豆素的荧光得以恢复。进一步细胞实验表明,TPP-H2S具有很好的细胞穿透能力以及被成功的应用于细胞及细胞内快速代谢的H2S的监测,而且通过活体解剖术,TPP-H2S首次实现了对小鼠不同组织内源性H2S含量的分析。(2)基于氯代香豆素-部花青染料,本工作设计了一种新型的、能够同时响应H2S和Cys的双光子荧光探针,实现对CBS/CSE活性的成像分析。为了区分H2S和Cys的荧光发射光谱,结合H2S与Cys的分子特点,设计了氯代香豆素和双键两个反应位点。探针与H2S和Cys反应时,反应第一阶段,前者形成巯基香豆素-部花青,后者因亲核基团-NH2的存在,在亲核取代过程中发生分子内重排反应形成氨基香豆素-部花青。随后,两者中间产物发生流基与双键的分子内成环反应,前者形成六元环,后者则形成七元环,造成产物的π电子结构不同,两者的荧光发射光谱区分开。由于生物体内Cys在CBS/CSE的催化作用下可以转化为H2S,因此可以通过检测H2S和Cys浓度的改变,表现为双光子荧光信号强度的相对变化,实现对细胞内CBS/CSE活性的成像分析。通过以上两个工作,本文初步实现了对H2S浓度的快速检测以及不同小鼠组织内的含量分析,更重要的是,实现了对能够改变H2S生理浓度的CBS/CSE活性的成像分析。基于此,本研究期望在人类对H2S生理浓度的检测及引起H2S浓度改变的深层生理机制提供潜在价值,为全方位掌控H2S的动态变化及一些生理疾病的诊断和治疗提供更有效的手段。