论文部分内容阅读
核桃富含芦丁,尤其内种皮,其含量高低直接影响核桃仁多酚积累,对种仁品质起着关键作用。芦丁具有良好的抗氧化、延缓衰老和提高免疫能力等功效,是保护人体健康的功能活性物质。研究核桃芦丁的生物合成对调控芦丁及相关酚类物质代谢具有重要意义。此前课题组克隆了铁核桃芦丁合成相关酶基因,幷测定其果实发育过程的转录组信息,对芦丁等相关酚类物质代谢途径进行初探。相关研究表明芦丁合成受多种代谢酶及基因调控,且与发育进程和器官特异性有关,但其主要代谢途径和关键酶尚未明确,仍需从多角度及层面进行探索。本研究以铁核桃‘黔核7号’果实为材料,通过广泛靶向代谢组学技术对幼果期（花后20d）、果实膨大期（花后50 d）、硬核期（花后80 d）、种仁充实期（花后110 d）、成熟期（花后140 d）的果实青皮和内种皮进行代谢组学分析。利用现有转录组数据,经转录组与代谢组关联分析,从基因转录水平和代谢物直观表型了解化合物的变化规律。同时测定芦丁及相关代谢物含量,分析相关基因表达及酶活性状况,进一步解析铁核桃果实发育过程芦丁的生物合成途径。本研究主要结果如下:1.对铁核桃‘黔核7号’果实青皮和内种皮进行代谢组学分析,共鉴定到23类719种代谢物,其中有机酸及衍生物的成分最多,共109种,原花青素和甾体的成分最少,均仅有3种。果实中含量最高的为脂质类物质,占总代谢物含量的20.62%,其次为有机酸及衍生物（11.33%）、氨基酸及衍生物（10.92%）、黄酮醇（8.40%）、糖类（6.05%）。青皮和内种皮中还检测到167种多酚及黄酮类化合物,其中原花青素B2的含量最高,占代谢物总含量的11.39%,其次为杨梅酮3-O-半乳糖苷（6.45%）,而木犀草素O-琥珀酸-O-己糖苷的含量最低,仅占代谢物总含量的0.05?。2.果实发育过程中,幼果期（花后20 d）至果实膨大期（花后50 d）青皮的代谢物下调最明显,358种差异代谢物有72.35%的含量显著降低,其次为果实膨大期（花后50 d）至硬核期（花后80 d）,133种差异种代谢物有62.41%的含量下调;而种仁充实期（花后110 d）、成熟期（花后140 d）代谢物含量总体上升,相邻阶段的117和178种差异成分中,分别有58.12%、52.25%的代谢物含量显著升高。内种皮中代谢物变化明显,硬核期（花后80 d）至种仁充实期（花后110 d）,226种差异代谢物有75.22%的含量显著降低,而种仁充实期（花后110 d）至成熟期（花后140 d）,240种差异成分有65.00%的含量显著升高。成熟期（花后140 d）青皮与内种皮的代谢物种类及含量差异最大,共有500种差异成分,其中221种上调,占44.20%,另外279种下调,占55.80%。3.青皮和内种皮代谢组分析中,均检测到香豆酰-CoA和咖啡酰-CoA两条途径中的酚酸和黄酮类物质,说明两条途径均可合成多酚及黄酮等次生代谢物。KEGG通路分析发现,咖啡酰-CoA侧重于合成松柏醇与芥子醇进入木质素代谢,而芦丁等黄酮醇物质主要由香豆酰-CoA途径生物合成。相关性分析表明,青皮中芦丁与L-苯丙氨酸、反式肉桂酸、柚皮苷查尔酮、柚皮素、二氢山奈酚、山奈酚、槲皮素、异槲皮甙呈显著或极显著正相关关系;内种皮中芦丁与对香豆酸、山奈酚呈显著和极显著负相关,而与反式肉桂酸、柚皮苷查尔酮、柚皮素、二氢山奈酚、槲皮素、异槲皮甙呈著显或极显著正相关关系。表明这些前体代谢物与芦丁合成关系密切,其含量高低最终决定芦丁的积累。4.转录组与代谢组关联分析筛选到19种芦丁相关合成酶,其中苯丙烷通路（Ko00940）:PAL、C4H、4CL、CAD、C3’H、COMT、CCoAOMT、β-Glucosidase、POD;类黄酮通路（Ko00941）:CHS、CHI、FLS、F3H、DFR、LAR;黄酮醇通路（Ko00944）:FOMT、F3`H、F3`5`H、UGT。三条通路中相关基因表达、酶活性与多酚、黄酮类物质含量关系密切,尤其内种皮中酚类物质含量随着相关基因表达量和酶活性的增强而明显上升。5.青皮中,幼果期（花后20 d）至硬核期（花后80 d）的芦丁含量显著降低,种仁充实期（花后110 d）略有升高,成熟期（花后140 d）时含量再次降低;内种皮中,芦丁从硬核期（花后80d）至成熟期（花后140 d）逐渐积累,成熟期含量显著高于其它阶段,此时的芦丁含量远高于青皮。基因表达及酶活相关分析发现,芦丁与PAL、C4H、4CL、COMT、CCoAOMT、CAD等上游基因表达量多为负相关关系,而与FLS、FOMT、F3`H、F3`5`H、UGT基因表达及酶活性呈显著或极显著正相关。青皮中基因表达与酶活相关性较弱,而内种皮基因表达与酶活性相关性较强,特别是FLS、FOMT、F3`H、F3`5`H、UGT等黄酮醇通路相关合成酶均为极显著正相关,说明内种皮富集芦丁是黄酮醇合成相关基因特异性表达的结果。