中红侧沟茧蜂化学感受蛋白鉴定及功能研究

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昆虫是动物世界中最多元化的类群,拥有多种多样的生命形态,几乎能够适应各种生态环境。为此它们进化出了高度敏感的化学感受器官,这是他们与环境相互作用和个体之间交流的核心。在昆虫中,表达在嗅觉器官中的气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)和化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)起着化学信号的检测与运输作用,介导昆虫的觅食、择偶、寄主定位等生理行为,它们对于昆虫适应环境和维持种群结构具有非常重要的生物学意义。因此,不管是基础研究还是生产应用,了解昆虫的嗅觉分子基础都显得非常重要。中红侧沟茧蜂Microplitis mediator(Haliday)是一种独居性内寄生蜂,寄主广泛,在农业生产中,广泛用于棉铃虫等棉田害虫的生物防治。通过分子生物学的手段研究中红侧沟茧蜂的嗅觉分子机制,可为害虫防治和天敌利用提供新的策略和方法,为生物防治提供新的靶标位点。本文通过筛选中红侧沟茧蜂触角转录组数据,鉴定出大量在触角中特异表达的OBPs基因和CSPs基因,并对CSP2和CSP3蛋白在中红侧沟茧蜂触角感器的表达及气味结合功能进行了研究。本文主要研究结果如下:  1.通过筛选中红侧沟茧蜂触角转录组数据,共鉴定10个新的OBPs基因(MmedOBP11~20)和2个新的CSPs基因(MmedCSP2~3)。MmedOBPs和MmedCSPs的序列比对发现,中红侧沟茧蜂的OBPs和CSPs的都属于“Classical”半胱氨酸模式。Motif分析表明中红侧沟茧蜂的CSPs比OBPs更加保守。系统进化分析结果表明MmedOBPs和MmedCSPs在进化过程中具有明显的分化现象。  2.利用Real-time Quantitative PCR分析了上述基因在中红侧沟茧蜂成虫不同组织的表达特征。结果显示MmedOBP14,MmedOBP18,MmedCSP2和MmedCSP3在触角中特异或高表达,表明它们可能参与了中红侧沟茧蜂的嗅觉识别过程。而其余的基因具有广泛的表达特征,推测其可能具有非嗅觉功能。  3.免疫组织化学对MmedCSP2和MmedCSP3蛋白在触角感器中的表达分布进行研究。结果显示,MmedCSP2特异表达在腔锥形感器中,而MmedCSP3在锥形感器中表达,表明这两个蛋白分别参与了不同化学感器的化学识别过程。  4.荧光竞争结合实验研究了MmedCSP2和MmedCSP3重组蛋白与102种潜在配体的结合特异性。实验结果显示,MmedCSP2结合反-2-己烯醛、柠檬醛、3,4-二甲基苯甲醛、苯甲醛、水杨酸甲酯、戊醛、B-紫罗兰酮、3-己酮和茉莉酸甲酯;MmedCSP3蛋白结合TMTT、DMNT、丁酸乙酯、水杨酸甲酯、油酸和棕榈酸,此外MmedCSP3与3种夜蛾科昆虫性信息素(Z11-16:OH,Z11-16:Ald,E11-14:Ac)有很强的亲和能力,这表明MmedCSP2与MmedCSP3可能在中红侧沟茧蜂检测植物挥发物方面发挥重要作用,MmedCSP3可能是中红侧沟茧蜂利用昆虫挥发物来定位寄主或配偶的关键蛋白。  5.同源模建对MmedCSP2和MmedCSP3的三维结构模型进行分析。结果表明MmedCSP2蛋白具有一个由7个α-螺旋构成的疏水性结合腔,和两对二硫键,分子对接实验预测Ser12,Tyr15,Leu50和Asn53可能是MmedCSP2与配体结合的关键位点。MmedCSP3蛋白具有较大的疏水结合腔,由5个α-螺旋构成,同样有两对二硫键来稳定蛋白结构,推测Ala22、Arg25、Gln26、Glu40、Asp41、Trp45和Tyr75可能是MmedCSP3结合配体的关键位点。
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