多药耐药(Multi-drug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药的同时，对其他结构和功能截然不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药的现象，是肿瘤化疗失败的重要原因。多药耐药相关蛋白1(Multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)在肿瘤耐药现象中起重要作用。多药耐药相关蛋白(MRP)可将化疗药物排出细胞外，改变药物在细胞内的分布，从而导致耐药的发生。它在人类多种肿瘤组织中表达较高并与耐药相关，从而导致肿瘤化疗的失败。 核酶(Ribozyme)是一类具有催化活性的小分子RNA，它能特异性地与靶mRNA分子结合进行切割，阻断目的基因的表达，被广泛应用于基因表达调控的研究。RNA干涉(RNA interference，RNAi)是双链小干涉RNA(small interferingRNA，siRNA)能引起特异性靶mRNA的裂解，从而阻断目的基因的表达。核酶和siRNA使基因表达沉默的共同特征都是作用于转录后的mRNA，属于转录后的基因沉默的机制。应用核酶和siRNA切割过度表达的MRPl基因转录的mRNA可以有效沉默MRPl的表达。从基因水平沉默MDR现象已成为当今的研究热点，在肿瘤基因治疗方面具有潜在的应用价值和前景。 本课题根据细胞表达的绿色荧光蛋白可直接通过荧光显微镜观察的优势，用EGFP作为报道基因，通过基因重组技术构建MRP1-EGFP融合基因，检测MRP1靶基因表达的沉默后效应。本实验根据计算机软件分析和文献报道，从MRP1全长基因里选择并截取了378bp的MRP1基因的靶序列，插入到增强型绿色荧光蛋白基因EGFP的上游，构建成MRP1-EGFP融合表达的重组质粒pEGFP/MRP1。利用多核酶体系沉默MRP1-EGFP基因的融合蛋白的表达以及MRP1全长基因的表达。同时根据MRP1靶序列选择了三个可能沉默MRPl的siRNA干扰序列，并构建了三个重组表达质粒pSIREN/MRPl-Ⅰ、pSIREN/MRP1-Ⅱ和pSIREN/MRP1-Ⅲ，利用RNAi技术研究了siRNA对MRPl靶基因片段和全长基因表达的沉默效应。把核酶和siRNA系列重组质粒分别与pEGFP/MRP1共转染人胚胎肾细胞HEK293，在荧光相差显微镜下观察绿色荧光蛋白MRP1-EGFP的表达。利用定量RT-PCR检测核酶和pEGFP/MRP1共转染时，MRP1靶序列的mRNA含量。把核酶和siRNA系列重组质粒分别与pcDNA3.1/MRPl共转染HEK293，通过Western blot检测核酶和siRNA重组质粒对重组质粒pcDNA3.1/MRPl表达的全长MRP1基因的沉默效应。 目的是探讨核酶和siRNA对目的基因表达的影响；同时探讨了单核酶与多核酶体系沉默目的基因表达效果的强弱；也筛选出对目的基因表达有显著影响的siRNA片段。本实验的研究结果表明，核酶对MRP1的mRNA具有剪切能力，并且含十个核酶单位的表达质粒pcDNA3.1/ribozymel0比仅含有一个核酶结构单位的质粒pcDNA3.1/ribozymel具有更好的剪切效果，从绿色荧光观察、RT-PCR、Western Blot三方面都得到了同样的结果。证明了核酶能通过转录的核酶RNA特异性切割 MRP1的靶mRNA，从而抑制或沉默MRP1基因的表达，而且核酶数量越多抑制效果越显著。 利用构建的siRNA表达质粒pSIREN/MRP1-Ⅰ、pSIREN/MRP1-Ⅱ和SIREN/MRP1-Ⅲ分别与表达MRPl靶基因的质粒pEGFP/MRP1共转染HEK293细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达结果显示，重组表达质粒pSIREN/MRP1-Ⅱ、pSIREN/MRP1-Ⅲ所表达的siRNA对MRP1基因都起到了转录后的沉默作用，尤其是表达质粒pSIREN/MRP1-Ⅱ对沉默MRP1基因的效果最为显著。siRNA的表达质粒pSIREN/MRP1-Ⅰ、pSIREN/MRP1-Ⅱ和pSIREN/MRP1-Ⅲ分别与表达全长MRP1的表达质粒pcDNA3.1/MRP1共转染HEK293细胞后，经过Western Blot杂交分析表明，pSIREN/MRP1-Ⅱ、pSIREN/MRP1-Ⅲ对MRP1的表达均有沉默作用，尤其是pSIREN/MRP1-Ⅱ对MRP1的表达沉默效应更为明显，而pSIREN/MRP1-Ⅰ基本上没有沉默效应，这与所观察到的绿色融合荧光蛋白的结果完全一致。 以上实验结果表明，不论是核酶还是siRNA都能够特异性沉默靶基因MRP1在mRNA水平和蛋白质水平的表达，但本实验结果不能证明核酶或siRNA哪一种特异沉默基因表达的技术更为优越。这两种沉默mRNA的机理虽然不同，但是两者都是转录后的沉默效应。本实验为基因治疗和进一步的研究提供了一定的理论依据。