前言 Ag85复合物是一分子量为30～32kDa的蛋白质家族,主要由Ag85A,Ag85B,Ag85C三种蛋白质组成,是结核分枝杆菌分泌蛋白和BCG培养滤液的主要成分。它们具有海藻糖双霉菌酸酯(即索状因子)生物发生所需的分枝酰转移酶活性,是分枝杆菌细胞壁的主要成分。其中Ag85A可能是细菌生长和维持毒力的最重要成分。以Ag85A为基础制备的DNA疫苗在动物实验中上调了机体的细胞免疫应答:诱导强烈的T细胞增殖,主要表现为以IL-2和IFN-γ等细胞因子分泌上调为特征的Th1型细胞免疫应答。 肿瘤是一种全球致死性疾病,目前尚无根治方法。一直认为在抗肿瘤免疫中CD8~+T细胞起主要作用。近年来,Th1细胞在抗肿瘤中的作用越来越受到关注。人们逐渐认识到在激活抗原特异性CTL的同时还要活化辅助性T细胞才能产生有效的抗肿瘤免疫。为了探讨Ag85A能否在肿瘤患者这样一个低细胞免疫应答的机体内激发Th1型细胞免疫应答,本实验通过给Meth-A纤维肉瘤荷瘤小鼠肌肉注射Ag85A DNA疫苗,观察该疫苗对荷瘤鼠Th1型细胞免疫应答的影响,作为我们研究Ag85A对肿瘤免疫治疗作用的第一步。 实验材料与方法 用碱裂解法从减毒伤寒杆菌中提取Ag85A-V1Jns.tpA质粒和V1Jns.tpA质粒,经琼脂糖凝胶电泳后,用凝胶回收试剂盒(QIA quick Gel Extraction Kit)回收所需质粒,然后转化JM109大肠杆菌。从转化成功的大肠杆菌提取质粒后,用Bgl Ⅱ限制性内切酶消化质粒,经琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。碱裂解法大量提取质粒后用聚乙二醇法纯化,调整浓度为1g/L,-20℃保存。