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目的:子宫内膜癌严重危害人类健康,迫切需要寻找广谱高效、低毒副作用的新型抗肿瘤分子治疗靶点。类泛素化Neddylation通路是一种新型蛋白质翻译后修饰方式。研究表明Neddylation通路在多种人类原发肿瘤组织中过度活化,可通过激活CRLs(Cullin-Ring ligases)泛素连接酶引起CRL抑癌蛋白底物降解而促进肿瘤发生发展,该通路NEDD8活化酶抑制剂MLN4924具有显著的体内外抗肿瘤效果。但MLN4924对子宫内膜癌细胞增殖的作用与机制研究鲜见报道。本研究旨在揭示Neddylation通路抑制剂MLN4924杀伤子宫内膜癌细胞的作用机制。方法:利用免疫印记(IB)明确MLN4924对子宫内膜癌细胞中的类泛素化Neddylation修饰通路的影响;采用ATPlite/CCK8细胞增殖法以及经典克隆形成分析评价MLN4924灭活Neddylation修饰通路对内膜癌细胞增殖、克隆形成的影响;利用免疫印记(IB)和细胞流式分析MLN4924对细胞周期、细胞DNA损伤应答、细胞凋亡以及CRL经典底物的表达和降解的影响;最后利用小RNA干扰技术(siRNA)做细胞表型拯救实验。结果:1.TCGA数据库分析,Neddylation通路中的关键分子NEDD8以及催化酶UBE2M和UBE2F在子宫内膜癌组织中的转录水平均高于癌旁组织。不同浓度的MLN4924处理子宫内膜癌细胞系(Ishikawa以及HEC-1-A),免疫印记分析(IB)显示:子宫内膜癌细胞内总体蛋白Neddylation修饰水平以及底物Cullins(Cullin1、2、3、4a、4b、5、7、9)蛋白Neddylation修饰水平均受抑制。2.CCK8和ATPlite细胞增殖检测方法显示MLN4924处理组的细胞活力低于对照组,且随着MLN4924浓度的增高,细胞活力越低。平板克隆形成实验显示MLN4924处理组的细胞克隆数目明显低于对照组。3.流式细胞仪PI染色细胞周期分析,MLN4924处理组细胞的细胞周期均阻滞在G2/M期。WB结果显示,MLN4924处理组的细胞中,与细胞周期相关的周期蛋白P21、P27、WEE1的表达均高于对照组。此外,与DNA损伤应答相关的蛋白标记物ORC1、CDT1以及p-H2AX的表达也明显高于对照组。4.流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色细胞凋亡分析,MLN4924处理组细胞发生细胞凋亡的比例明显多于对照组,且MLN4924浓度越高,细胞凋亡的比例也越高。WB结果显示,MLN4924处理组的细胞中,细胞凋亡的蛋白标记物剪切PARP(C-PARP)蛋白和剪切casp-3(C-casp-3)蛋白表达均升高,且促凋亡蛋白Noxa表达显著上调,siRNA下调Noxa后,处理组中C-PARP、C-casp-3以及p-H2AX蛋白表达均有所回补。结论:1.Neddylation通路在子宫内膜癌临床样本中活化,MLN4924可以显著抑制子宫内膜癌细胞中的类泛素化Neddylation修饰通路。2.MLN4924显著抑制子宫内膜癌细胞的增殖。3.MLN4924诱导子宫内膜癌细胞发生细胞周期G2期阻滞、细胞DNA损伤应答以及细胞凋亡而最终杀伤肿瘤细胞。4.MLN4924激活细胞凋亡通路部分是通过促凋亡蛋白Noxa所介导的,敲低Noxa可以显著挽救子宫内膜癌细胞的凋亡表型。