背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率已上升至女性恶性肿瘤第一位，严重威胁女性的生命健康。随着现代手术技术的提高以及化疗、放疗等辅助治疗手段的应用，乳腺癌患者的总体生存率得到了改善，但是每年仍有30%-40%的患者出现复发和转移，导致患者死亡[1-3]。因此，在临床研究中迫切需要寻找一种有效的乳腺癌治疗手段。肿瘤靶向性溶肿瘤病毒（Tumour-targeted oncolytic virus，TOVS）是目前恶性肿瘤研究的新热点，其原理在于溶瘤病毒可以特异性地在肿瘤细胞中复制，进而溶解肿瘤细胞，而这种溶瘤作用对正常细胞无影响[4-5]。研究发现TOV可通过多重作用机制来发挥抗肿瘤效果，包括直接溶解细胞、表达毒性蛋白、诱导细胞凋亡、深入诱导抗肿瘤免疫以及关闭宿主蛋白合成等，正是病毒治疗机制的多样性，国际上越来越多的研究者开始把目光转移到溶瘤病毒治疗方面来[6-7]。最近研究发现痘苗病毒N1L蛋白是引起神经毒性的重要因素，同时该基因产物可通过与IKK复合物的靶向结合来抑制NF-kB和IRF3活性，诱导细胞凋亡，从而拮抗宿主细胞的免疫反应[8-10]。因此，N1L的删除不仅可增加TOV安全性，更重要的是增强机体对其更强的免疫反应，有可能增强其抗肿瘤效果。我们实验室在VV△TK（在野生型Lister痘苗病毒的基础上敲除Tymidine Kinase（TK）基因的病毒株）的基础上敲除N1L基因来降低病毒毒性，同时并期望能够激起机体更强的免疫反应。本研究通过体外、体内对比研究该病毒对小鼠4T1乳腺癌的治疗效果和生物安全性。目的探讨新型肿瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP及VV△TK对小鼠4T1乳腺癌的治疗作用。方法第一部分：溶瘤病毒的制备及鉴定，采用聚合酶链式反应（PCR）方法检测溶瘤痘苗病毒TK及N1L基因的删除；第二部分：体外，检测溶瘤病毒对4T1细胞毒性，即采用MTS（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulphophenyl)-2H-tetrazolium）法检测新型肿瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP和对照痘苗病毒VV△TK对BALB/c小鼠乳腺癌细胞株4T1的杀伤作用，计算其EC50值（即杀死50%细胞所需要的病毒量）；采用TCID50(Tissue culture infective dose50%)法检测新型肿瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP和对照痘苗病毒VV△TK在乳腺癌细胞株4T1中的复制能力；第三部分：体内实验，通过建立小鼠4T1乳腺原位及转移模型，检测新型肿瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP和对照痘苗病毒VV△TK对其治疗效果。结果第一部分：病毒制备成功，并且最高滴度可达1011pfu/ml,病毒经过PCR检测证实，溶瘤痘苗病毒VV△TK基因序列中TK基因被删除，新型肿瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP基因序列中TK及N1L基因被删除。第二部分：在体外研究中，新型肿瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP的EC50平均值±标准差为（1.90±0.1）pfu/cell，对照痘苗病毒VV△TK的EC50平均值±标准差为（7.18±2.2）pfu/cell，说明VV△TK△N1L-RFP对4T1细胞的杀伤作用比VV△TK明显增强(P＜0.05)。新型肿瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP感染4T1乳腺癌细胞后，不同时间点（24h、48h、72h）的病毒复制量分别为：30.89pfu/cell、43.04pfu/cell、43.95pfu/cell，对照病毒VV△TK感染4T1乳腺癌细胞后，不同时间点（24h、48h、72h）的病毒复制量分别为：36.87pfu/cell、52.19pfu/cell、60.91pfu/cell，说明两种肿瘤靶向性溶瘤痘苗病毒均能在4T1细胞中复制，但两者相比差异无统计学意义(P＞0.05)。第三部分：在体内研究方面，分别成功建立了小鼠4T1乳腺癌原位模型、小鼠4T1乳腺癌自发转移模型和小鼠4T1乳腺癌术后自发转移模型。通过体内实验发现：手术前瘤内分别注射新型肿瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP、对照痘苗病毒VV△TK和空白对照PBS，小鼠4T1乳腺肿瘤体积的缩小虽然没有明显差别，但是经过新型溶肿瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP治疗过的小鼠手术后生存时间得到了明显延长。结论新型肿瘤靶向性溶瘤痘苗病毒VV△TK△N1L-RFP和对照痘苗病毒VV△TK体外对小鼠4T1乳腺癌均有很好的杀伤效果，手术前使用VV△TK△N1L-RFP比对照痘苗病毒VV△TK显示更强的抗肿瘤效果，可能为如何减低乳腺癌术后转移和延长生存率提供了一种新的治疗方法。