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目的:本研究用腺病毒或慢病毒感染人脂肪干细胞,通过细胞培养、Real-timePCR、免疫荧光和Western blotting等实验方法证明miR-150通过靶向调控Notch3/FAK/ERK1/2负向调控人脂肪干细胞(hADSCs)的成骨分化。为骨损伤骨缺损等治疗提供新的思路。研究方法:1.体外条件下,培养人脂肪干细胞,将三组细胞:N组,GFP组,miR-150组于六孔板中培养。用过表达miR-150的腺病毒感染hADSCs。Realtime-PCR检测miR-150的表达;Western blotting检测Notch3的表达水平。Western blotting检测FAK、pFAK、ERK1/2、pERK1/2、ROHA等成骨信号通路相关蛋白。用免疫荧光检测FAK、pFAK、ERK1/2、pERK1/2、RhoA、F-actin的蛋白表达。CCK8检测miR-150对hADSCs增殖的影响。2.将四组细胞:GFP组,Notch3-siR1组,Notch3-siR2,Notch3-siR3组于六孔板中培养。用敲除Notch3的慢病毒感染hADSCs。Western blotting检测Notch3的表达水平。Western blotting检测FAK、pFAK、ERK1/2、pERK1/2、RhoA等成骨信号通路相关蛋白。3.将三组细胞:N组,GFP组,miR-150inhibitor组于六孔板中培养。用miR-150抑制剂处理hADSCs。Western blotting检测Notch3的表达水平。Western blotting检测FAK、pFAK、ERK1/2、pERK1/2、RhoA等成骨信号通路相关蛋白。用免疫荧光检测FAK、pFAK、ERK1/2、pERK1/2、RhoA、F-actin的蛋白表达。4.将四组细胞:N组,N+OM组,GFP+OM组,miR-150+OM组于六孔板中培养。利用成骨诱导液诱导hADSCs成骨分化。Western blotting检测成骨标志物RUNX-2。用碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨效果。5.将五组细胞:N组,GFP组,GFP+OM组,Notch3-siR2+OM组,Notch3-siR3+OM组于六孔板中培养。利用成骨诱导液定向诱导hADSCs成骨分化。Western blotting检测RUNX-2的表达水平。用碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨效果。用碱性磷酸酶(ALP)活性鉴定成骨效果。6.将四组细胞:N组,N+OM组,GFP+OM组,miR-150inhibitor+OM组于六孔板中培养。利用成骨诱导液诱导hADSCs成骨分化。Western blotting检测成骨标志物RUNX-2。用碱性磷酸酶(ALP)染色和活性鉴定成骨效果。结果:1.包装miR-150的腺病毒已成功感染hADSCs。CCK8结果显示,各组吸光度值随着时间(1d、3d、5d、7d)的增加而增加,但miR-150组的细胞增殖趋势明显低于GFP组与N组。Western blotting检测结果显示,在miR-150组Notch3、pFak、pERK1/2蛋白的表达量明显低于N组和GFP组,而FAK、ERK1/2蛋白的表达量无明显变化。免疫荧光结果显示miR-150组pFAK、pERK1/2、RhoA、F-actin蛋白的表达量明显低于GFP组与N组。2.Western blotting检测结果显示,在Notch3-siR2、3组Notch3、pFAK、pERK1/2蛋白的表达量明显低于GFP组,而FAK、ERK1/2蛋白的表达量无明显变化。3.Western blotting检测结果显示,在miR-150inhibitor组Notch3、pFAK、pERK1/2、RhoA蛋白的表达量明显高于N组和GFP组。通过免疫荧光检测结果显示,在mi R-150组pFAK、pERK1/2、RhoA、F-actin蛋白的表达量明显高于N组和GFP组。4.成骨诱导7d后,Western blotting检测发现,miR-150+OM组RUNX-2蛋白表达量明显低于N组和GFP组。并且ALP活性检测结果显示,miR-150组ALP活性低于GFP+OM组。ALP染色结果所示,与GFP+OM组比较,miR-150组ALP染色强度减弱。5.成骨诱导7d后,Western blotting检测发现,Notch3-siR2、3+OM组RUNX-2蛋白表达量明显低于N+OM组和GFP+OM组。并且ALP活性检测结果显示,Notch3-siR2、3+OM组ALP活性低于N+OM组和GFP+OM组。ALP染色结果所示,同N+OM组和GFP+OM组比较,Notch3-siR2、3+OM组ALP染色强度减弱。6.成骨诱导7d后,Western blotting检测发现,miR-150inhibitor+OM组RUNX-2蛋白表达量明显高于于N组和GFP组。并且ALP活性检测结果显示,miR-150inhibitor组ALP活性高于N组和GFP组。ALP染色结果所示,同N组和GFP组比较,miR-150inhibitor组ALP染色强度增强。结论:实验结果表明过表达miR-150显着抑制hADSC成骨分化,miR-150过表达后,FAK、ERK1/2的磷酸化减弱,RhoA的表达降低。而敲除miR150极大地促进了这一过程。敲除Notch3的表达后同样抑制了hADSC的成骨分化。敲除Notch3后FAK、ERK1/2的磷酸化减弱,RhoA的表达降低。我们的研究表明,miR150通过靶向调控Notch3/FAK/ERK1/2负调节hADSCs的成骨分化。miR150通过靶向调控Notch3/RhoA负调节hADSCs的成骨分化。