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捻转血矛线虫病是由小反刍动物感染捻转血矛线虫引起的一种寄生性蠕虫病,主要造成小反刍动物生产性能的降低。捻转血矛线虫的感染在全世界范围内造成了很大的经济损失。捻转血矛线虫是吸血寄生虫,能够刺破宿主的皱胃粘膜吸食宿主血液,造成宿主贫血和总血浆蛋白的损失。寄生性线虫对其宿主免疫反应的调节和抑制被广泛的报道,虫体所释放的排泄分泌蛋白被认为在这一过程中发挥关键的作用。本文观察和研究了 6种捻转血矛线虫排泄分泌蛋白对山羊单核巨噬细胞功能的影响。1捻转血矛线虫HCMIF-1的分子鉴定及其对山羊单核细胞功能的调节寄生性线虫的巨噬细胞移动抑制因子同系物是一类重要的免疫调节分子。在本研究中,我们克隆和表达了捻转血矛线虫的一个巨噬细胞移动抑制因子同系物（HCMIF-1）,并对它的生物学特性进行了分析。酶活性分析显示,重组HCMIF-1蛋白（rHCMIF-1）具有互变异构酶活性。对虫体的免疫组织定位表明天然HCMIF-1蛋白主要表达于虫体的体壁和肠道组织的内表面。rHCMIF-1可以被人工感染捻转血矛线虫的山羊血清所识别,同时还可以在体外和山羊单核细胞结合。通过ELISA检测发现,与rHCMIF-1作用后山羊单核细胞TNF-α、IL-1β和IL-12p40的分泌水平显著增加,IL-10和TGF-β1的分泌受到抑制。荧光单克隆抗体标记结合流式细胞术分析发现,山羊单核细胞表面MHC-II分子的表达在与rHCMIF-1作用后显著减少。在与rHCMIF-1共孵育后,山羊单核细胞LPS诱导的一氧化氮（NO）产生被抑制。通过流式细胞术检测发现,rHCMIF-1能够显著抑制山羊单核细胞对FITC标记的葡聚糖的吞噬作用。2捻转血矛线虫HCcyst-2分子的鉴定及其对山羊单核细胞功能的调节寄生性线虫所分泌的半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以对其宿主免疫系统发挥广泛的调节效应。在本研究中,我们对捻转血矛线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂（HCcyst-2）进行了克隆和原核表达,并分析了其相关生物学特性。对半胱氨酸蛋白酶抑制活性分析表明,重组HCcyst-2蛋白（rHCcyst-2）能有效抑制组织蛋白酶B、组织蛋白酶L和木瓜蛋白酶的酶活性。蛋白免疫印迹分析表明人工感染捻转血矛线虫的山羊血清可以识别rHCcyst-2。HCcyst-2天然蛋白主要分布于虫体的外表面和肠道的内表面。免疫荧光分析表明rHCcyst-2可以被山羊单核细胞在体外所摄取。与不同浓度的rHCcyst-2共培养后,共培养细胞上清中的TNF-α、IL-1β和IL-12p40的水平显著降低,而IL-10却明显增加。与rHCcyst-2作用后,LPS诱导的山羊单核细胞NO产生显著增加。流式细胞术检测发现,,rHCcyst-2可抑制山羊单核细胞MHC-Ⅱ分子的表达,对MHC-I分子的表达没有影响,单核细胞对FITC标记的葡聚糖的吞噬同时受到抑制。3捻转血矛线虫HCcyst-3分子的鉴定及其对山羊单核细胞功能的调节在本研究中,我们克隆了捻转血矛线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因（HCcyst-3）,利用原核表达体系产生其重组蛋白（rHCcyst-3）。酶活性试验显示,rHCcyst-3能有效抑制其靶酶组织蛋白酶B、组织蛋白酶L和木瓜蛋白酶的酶活性。Western印迹显示,rHCcyst-3可以被人工感染捻转血矛线虫的山羊血清所识别。免疫荧光分析发现,山羊单核细胞能够在体外摄取rHCcyst-3。为观察体外rHCcyst-3对山羊单核细胞的调节效应,将不同浓度的rHCcyst-3与山羊单核细胞共培养。ELISA检测发现,培养上清中的细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-12p40水平显著下降,而IL-10和TGF-β1显著增加。rHCcyst-3同时能提高山羊单核细胞LPS诱导的NO的释放。流式细胞术分析发现,rHCcyst-3可有效抑制山羊单核细胞表面MHC-Ⅱ的表达,同时能抑制其对FITC标记的葡聚糖的吞噬。4捻转血矛线虫HCRD、HCETFα和HCPTPA基因的克隆、原核表达和生物学特性分析在本研究中,利用RT-PCR技术对捻转血矛线虫的硫氰酸酶基因（HCRD,GenBank登录号:CDJ82729.1）、电子转移黄素蛋白α亚基基因（HCETFα,GenBank登录号:CDJ97208.1）及酪氨酸磷酸酯酶活化因子结构域包含蛋白基因（HCPTPA,GenBank登录号:CDJ84273.1）进行了扩增。序列分析显示:HCRD基因ORF长度为1332 bp,编码443个氨基酸,理论蛋白分子量为50.6 kDa;HCETFα基因ORF长度为996 bp,编码331个氨基酸,理论蛋白分子量为34.5 kDa;HCPTPA基因ORF长度为987 bp,编码328个氨基酸,理论蛋白分子量为38.3 kDa。随后将3个基因亚克隆至pET-32a表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）后均成功表达。重组蛋白rHCRD、rHCETFα和rHCPTPA均表达于包涵体中,大小分别为70.6kDa、54.5kDa和58.3 kDa左右。免疫组织定位表明,天然的HCRD、HCETFα和HCPTPA蛋白主要分布于虫体的体壁和肠道的内表面。rHCRD、rHCETFα和rHCPTPA可以被人工感染捻转血矛线虫的山羊血清所识别,也可以和山羊PBMC在体外结合。5捻转血矛线虫重组蛋白rHCRD、rHCETFα和rHCPTPA调节山羊PBMC和单核细胞功能的研究本研究旨在观察3种捻转血矛线虫重组蛋白rHCRD、rHCETFα和rHCPTPA在体外对山羊PBMC和单核细胞功能的影响。用不同浓度的重组蛋白与分离的山羊PBMC共孵育,观察不同处理对山羊PBMC细胞增殖、迁移及NO释放的影响,用ELISA检测不同处理后细胞培养上清中IL-2、IL-4、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α及TGF-β1的分泌,用流式细胞术检测不同处理对细胞凋亡的影响。通过贴壁分离的山羊单核细胞与不同浓度的重组蛋白共孵育后,用流式细胞术检测不同处理对山羊单核细胞表面MHC分子的表达及其吞噬功能的影响。结果显示:rHCRD、rHCETFα和rHCPTPA均能显著抑制山羊PBMC在ConA刺激下的增殖,rHCETFα和rHCPTPA能显著诱导山羊PBMC的凋亡;经rHCETFα作用后,山羊PMBC的NO释放显著增加,而rHCPTPA却能抑制山羊PMBC的NO释放;20μg/ml的rHCETFα显著促进山羊PMBC的迁移,20 μg/ml和40 μg/ml的rHCPTPA显著抑制PBMC的迁移;与rHCRD作用后,山羊PBMC在ConA刺激下的IFN-γ和TNF-α的分泌显著减少,而IL-10的分泌显著增加,40 μg/ml的rHCRD显著增加TGF-β1分泌;在rHCETFα的刺激下,山羊PBMC IL-2、IL-4和IL-17A的分泌受到显著抑制,而TGF-β1的分泌显著增加;与rHCPTPA共孵育后PBMC培养上清中IL-2和IFN-y的水平显著降低,而IL-4和IL-10却显著增加;rHCRD和rHCETFα能显著抑制山羊单核细胞的吞噬功能,与rHCPTPA作用后,山羊单核细胞吞噬功能没有显著变化;rHCRD显著抑制山羊单核细胞表面MHC Ⅱ分子的表达。