论文部分内容阅读
魔芋为天南星科魔芋属多年生草本植物,广泛分布于我国西南山区,因其球茎富含葡甘聚糖而具有较高的利用价值。魔芋软腐病是由胡萝卜软腐欧文氏菌属胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)引起的细菌性病害,我国大部分魔芋产区均有此病的发生,严重时造成魔芋毁灭性灾害。然而,魔芋中尚未发现抗软腐病种质资源。病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins,PR)是植物在病原入侵的病程过程中诱导表达的一类蛋白质,具有广谱抗病性。但由于病程相关蛋白是一个庞大的基因家族,家族中不同成员对病原菌的抗性存在一定特异性。病程相关蛋白基因StPRp27是马铃薯病程相关蛋白基因,属于PR-17家族。本课题首先对该基因蛋白对魔芋软腐病菌的抑制作用进行研究,在此基础上利用植物表达载体转化魔芋,以获得抗魔芋软腐病的转基因系,为魔芋抗软腐病基因工程育种奠定基础。主要研究结果如下:1.StPRp27蛋白对魔芋软腐病菌具有明显的抑制作用。将马铃薯病程相关蛋白基因StPRp27亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,得到原核表达质粒pGEX-StPRp27,并将其转化原核表达宿主菌E.coli菌株BL21(DE3)进行原核表达。不同诱导条件表达结果显示,在IPTG浓度为0.1mM、温度为22℃时,可以获得可溶性GST-StPRp27蛋白。进一步纯化得到了分子量大小约51kd的GST-StPRp27融合蛋白,该蛋白抑菌试验结果表明,GST-StPRp27融合蛋白较谷胱甘肽(GST)蛋白具有更强的抑制魔芋软腐病菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)生长的效果,随着浓度的增加抑菌效果增强,当GST-StPrp27浓度增加到0.08mM时,病菌基本停止生长,证明StPRp27对魔芋软腐病菌的生长具有明显抑制作用。2.花魔芋转化受体筛选。试管苗形态学下部叶柄切段愈伤组织诱导率达到100%,且诱导形成的愈伤组织较大;而试管苗形态学上部叶柄切段愈伤组织诱导率只有54.4%,诱导形成的愈伤组织也较小;试管苗形态学中部叶柄切段愈伤组织诱导能力则介于上部和下部之间。研究还发现,部分预培养3周的叶柄切段已经诱导形成了愈伤组织,并且叶柄切段间状态存在明显差异;而预培养两周的花魔芋试管苗叶柄切段无明显愈伤组织形成,叶柄切段间状态差异亦不明显。以预培养2周的叶柄作为转化受体较为适宜。3.花魔芋转化体系的建立与转基因植株获得。在以预培养2周的试管苗叶柄切段为外植体进行遗传转化时,经共培养和脱菌培养后,转化前密度均小于水的叶柄切段有一部分密度变得比水大,在随后的筛选培养过程中这部分叶柄切段不能诱导愈伤组织的生成。抗性愈伤组织转入分化培养后,初期分化形成的不定芽均为畸形芽,不能发育成正常植株,抗性愈伤组织经过在分化培养基上继续培养后,可形成正常植株。本研究共分化得到66株抗性试管苗,其中经PCR检测为阳性的有28株。