肺癌是中国发病率最高的癌症^[1],也是全球范围内致死率最高的癌症^[2]。据美国国立卫生研究院（NIH）流行病学及最终结果监视项目（SEER）统计,2018年肺癌致死数占所有癌症致死总数的25.3%^[3]。虽然近年来肺癌相关的基础研究和临床诊疗已经取得了显著的进展,但是,由于肺癌发病机制的复杂性及顽固性耐药的不断涌现,肺癌患者长期生存率偏低的现状仍无明显改善,五年生存率依然低至18.6%^[3]（2008-2014）。Wnt信号通路作为经典的干细胞通路,在胚胎发育与肿瘤恶性生物学行为等方面发挥着重要作用^[4]。经典Wnt信号通路通过调控β-catenin蛋白的核浆分布来影响转录因子TCF4的活性,进而影响相应靶蛋白的表达^[5]。Ras相关结构域家族（Ras-association domain family,RASSF）由十名成员组成,分为两大类:经典RASSF（1-6）和N-端RASSF（7-10）^[6]。经典RASSF蛋白的Ras相关结构域（RA结构域）在肽链的C端,且它们都含有SARAH结构域^[7]。N-端RASSF的RA结构域在肽链N端,且它们都不含有SARAH结构域^[8]。据预测,RASSF7、8、10都含有螺旋结构（coiled-coil）^[8],且研究表明,含有螺旋结构的蛋白能够影响Wnt通路的活性^[9],而RASSF10在非小细胞肺癌中的生物学功能尚无文献报道。因此,RASSF10对非小细胞肺癌发挥何种作用,是否是通过影响Wnt来实现的,这些都是我们感兴趣的问题。目的:本研究中,我们通过检测RASSF10在非小细胞肺癌病理标本中的表达及临床病理因素、预后之间的关系,确定RASSF10在非小细胞肺癌中低表达;而后我们通过在非小细胞肺癌细胞系转染RASSF10及多种剪接体,观察细胞生物学行为的改变及Wnt通路的改变,旨在阐明RASSF10在非小细胞肺癌中发挥作用的可能机制。研究方法:收集了136例中国医科大学附属第一医院的非小细胞肺癌病理标本（患者行手术切除前未经放化疗治疗,并具有较完整随访资料）及43例癌旁正常组织（距癌组织>3cm）。通过免疫组织化学方法检测了RASSF10在病理标本中的表达,分析其表达与临床病理因素及不良预后之间的关系。收集了28例于2016年手术切除的新鲜肺癌组织标本,通过Western blot方法检测了RASSF10在癌组织及对应癌旁组织的表达情况。对TCGA的肺癌数据库进行了临床信息挖掘,对RASSF10的mRNA水平与患者生存时间进行了统计分析。通过Western blot方法检测了肺癌细胞系中RASSF10的表达情况,又分别在表达量高或低的细胞系中分别干扰或过表达RASSF10,通过MTT、克隆形成实验、侵袭实验探究了RASSF10对肺癌细胞恶性生物学行为的影响。用Western blot、荧光素酶报告基因及qPCR等实验检测了肺癌细胞中干扰或过表达RASSF10后,对Wnt信号通路及下游靶基因c-Myc、cyclinD1、MMP7等的转录和翻译水平的影响。通过构建和转染RASSF10、RASSF10-△RA和RASSF10-△CC等剪接体,观察RASSF10剪接体对肺癌细胞的影响,探讨RASSF10发挥作用的可能机制。结果:1、与癌组织中RASSF10低表达相比,正常肺组织中RASSF10呈现出高表达状态,且RASSF10在细胞核与细胞浆中均有表达。RASSF10的低表达与肺癌的低分化、高TNM分期和阳性淋巴结转移都呈正相关。Kaplan-Meier生存分析显示,RASSF10低表达的肺癌患者的生存时间明显短于RASSF10高表达的患者。COX回归分析结果显示,RASSF10低表达是影响肺癌患者预后的独立危险因素。TCGA肺癌数据库中,RASSF10高转录组的预后要明显好于低转录组（P=0.003）,无瘤的患者中RASSF10高转录的比例要明显高于有瘤的患者（P=0.01）。2、选择RASSF10表达相对较高的A549细胞系进行转染和干扰,选择RASSF10表达较低的H460、H292细胞系进行过表达质粒转染,选择RASSF10表达相对较高的HBE、H1299细胞系进行表达干扰,而后进行细胞功能学实验,发现转染RASSF10抑制了A549、H460、H292细胞的克隆形成能力和迁移能力,而干扰RASSF10促进了A549、HBE的克隆形成能力,也促进了A549、H1299的迁移能力。3、转染RASSF10之后Wnt通路的TOPFlash转录活性明显降低,Wnt通路下游靶基因c-Myc、cyclinD1、cJun、MMP7、Axin2的mRNA及蛋白质水平也都在转染RASSF10之后降低。经典Wnt通路主要成员LRP6、Axin1、GSK3β、Dvl2的总蛋白水平没有明显变化,而1490位点磷酸化的LRP6水平却明显降低。转染RASSF10之后,虽然β-catenin总量没有明显变化,但是33、37、45位点磷酸化的水平都有升高。核浆分离实验结果显示,转染RASSF10后,细胞核中β-catenin的水平明显减少,免疫荧光实验也证明了上述结果。而在干扰LRP6表达的细胞中转染RASSF10后,TOPFlash转录活性降低的现象消失,说明RASSF10抑制Wnt通路的作用是通过LRP6来实现的。4、免疫共沉淀实验证实内源性与外源性RASSF10都能与LRP6结合。Pull-down实验证实RASSF10与LRP6有结合的结构性基础。免疫荧光结果证实RASSF10与LRP6存在共定位。LRP6-M5突变体是不能被磷酸化的LRP6,在Wnt3A刺激下,LRP6-M5不能与RASSF10结合,而野生型LRP6则能与RASSF10结合,且结合在Wnt3A刺激下增加。5、在以上实验结果的基础上,我们对RASSF10结构域进行了分析,而后构建了四个RASSF10剪接体。对A549细胞转染了RASSF10剪接体后,细胞功能学实验和荧光素酶报告实验都证明了ΔCC剪接体与野生型RASSF10功能的差异最大。ΔCC剪接体不能与p-LRP6结合且在转染ΔCC剪接体时,p-LRP6水平增加的最明显。以上结果说明RASSF10的coiled-coil结构是其发挥作用的关键。结论:1、与正常肺组织相比,RASSF10在非小细胞肺癌组织中低表达,其低表达与患者的不良预后正相关;2、RASSF10能够抑制Wnt通路的活性,进而抑制肺癌细胞系的恶性生物学行为;3、RASSF10与LRP6结合,来发挥抑制Wnt通路的作用;4、RASSF10的生物学功能依赖于coiled-coil结构。