目的:急性缺血性中风的临床治疗一直缺乏行之有效的治疗方法。如何抑制急性缺血性中风脑组织的坏死以及凋亡水平是治疗和恢复的关键。应激颗粒的产生可以抑制凋亡的产生,并且可以被表观机制调控。在本课题组的前期研究中发现,开窍急救名方醒脑静中的活性成份-左旋樟脑对急性缺血性中风具有保护作用。因此本论文研究左旋樟脑通过表观调控miR-335的生成过程进而促进应激颗粒生成,保护急性缺血性中风损伤脑组织的作用机制。本论文可以促进中医开窍理论发展,为开窍药物在临床防治中风提供理论依据,为新一代抗中风新药奠定基础。方法:1.第一章中通过大鼠MCAO模型和PC12无血清刺激模型,研究左旋樟脑对急性缺血性中风损伤的保护作用。(1)构建大鼠MCAO模型,miRNA基因芯片分析特异性表达的miRNA并通过RT-qPCR验证;(2)尾静脉注射左旋樟脑注射液干预大鼠MCAO模型,通过TTC染色法、TUNEL法、western blotting法以及RT-qPCR法检测各组脑梗死体积、凋亡水平、METTL3蛋白表达以及pri-pre-mature-miR-335的表达;(3)在PC12细胞OGD/R模型中,加入醒脑静注射液的多种有效成分,通过流式细胞术检测各组细胞的TIA1表达量,以此判断醒脑静注射液有效成分对应激颗粒生成的作用;(4)使用PC12细胞OGD/R模型,通过流式细胞术、免疫荧光双标、western blotting法以及RT-qPCR法检测各组的凋亡水平、应激颗粒生成、METTL3蛋白表达以及pri-pre-mature-miR-335的表达;(5)在PC12细胞OGD/R模型中,加入醒脑静注射液的多种有效成分,通过RT-qPCR法检测各组细胞的RBM3 mRNA的表达量;(6)在PC12细胞OGD/R模型中,通过使用western blotting法和MeRIP实验检测细胞核中的RBM3表达量以及pri-miR-335甲基化水平。2.第二章中通过大鼠MCAO模型和PC12无血清刺激模型,研究miR-335促进应激颗粒生成保护脑损伤的作用机制。(1)TTC染色法、免疫组织化学法以及TUNEL法检测大鼠MCAO模型不同再灌时间点的脑梗死体积、应激颗粒生成以及凋亡水平;(2)在大鼠MCAO模型中侧脑室注射miR-335模拟物以及抑制物,通过TTC染色、TUNEL法、免疫组织化学、western blotting法以及免疫沉淀法检测不同组别(正常组、模型组、miR-335模拟物组和miR-335抑制剂组)的脑梗死体积、凋亡水平、应激颗粒的生成、相关蛋白表达(BCL-2、active caspase-3、ROCK2以及TIAI)以及TIA1的磷酸化水平;(3)通过生物信息网站预测miR-335的作用靶点,通过双荧光素酶报告基因验证靶蛋白;(4)通过脂质体转染miR-335模拟物以及抑制物进入PC12细胞,通过无血清刺激造模。通过免疫荧光法、western blotting法、流式细胞术检测miR-335对靶蛋白ROCK2的抑制作用,以及对应激颗粒生成的影响;(5)通过RNA干扰技术,设计ROCK2的siRNA并用脂质体转染进入PC12细胞,研究miR-335与ROCK2的靶点特异性。3.第三章中通过大鼠MCAO模型和PC12细胞OGD/R刺激模型,研究急性缺血性中风时miR-335表达下降的分子机制。(1)构建大鼠MCAO模型,TTC染色法、TUNEL法、western blotting、RT-qPCR以及免疫荧光双标法,检测大鼠MCAO模型不同再灌时间点的脑梗死体积、凋亡水平、METTL3表达量、pri-pre-mature-335的表达量以及应激颗粒的生成;(2)构建PC12细胞以及原代大鼠皮质神经元细胞的OGD/R模型,通过免疫荧光双标、western blotting、RT-qPCR以及流式细胞术,检测细胞模型不同糖氧恢复时间点的应激颗粒的生成、METTL3表达量、pri-pre-mature-335的表达量以及细胞凋亡水平;(3)通过MeRIP实验检测PC12细胞OGD/R刺激不同糖氧恢复时间点的pri-miR-335的甲基化水平;(4)CRISPR-Cas9技术敲除以及过表达PC12细胞的METTL3基因,通过MeRIP法和RT-qPCR检测敲除/过表达后的pri-miR-335的甲基化水平变化以及pri-pre-mature-335的表达量的变化;(5)通过生物信息网站预测miR-335的作用靶点,通过双荧光素酶报告基因验证靶蛋白;(6)通过脂质体转染miR-335模拟物以及抑制物,western blotting检测靶蛋白Erf1的表达,验证靶向性;(7)通过RNA干扰技术对PC12细胞的Erf1基因进行沉默并且过表达PC12细胞的Erf 1基因,通过免疫荧光双标法和流式细胞术检测应激颗粒的生成以及细胞凋亡水平;(8)通过RT-qPCR,检测RBM3的组织特异性以及在MCAO时的表达特异性;(9)通过Co-ip实验检测细胞核中METTL3以及RBM3的相互作用,并通过MeRIP实验检测pri-miR-335的甲基化水平;(10)通过Chip-qPCR的方法检测METTL3和RBM3与miR-335启动子区域的结合率;(11)通过siRNA对PC12细胞进行RBM3的RNA干扰实验,并通过Chip-qPCR的方法检测METTL3与miR-335启动子区域的结合率;(12)通过 RT-qPCR 法和 MeRIP 法,检测 RBM3-OE 以及 RBM3-siRNA 的 pri-miR-335的表达量以及甲基化水平。结果:1.通过第一章实验研究发现:(1)采用miRNA基因芯片检测大鼠缺血皮质中特异性表达的miRNA并采用RT-qPCR法验证。结果表明miR-335在MCAO大鼠中表达特异性减少。(2)与模型组相比,左旋樟脑明显降低了 MCAO模型大鼠大脑皮质的梗死面积和凋亡水平;(3)与模型组相比,左旋樟脑明显降低了 MCAO模型大鼠大脑皮质的凋亡水平;(4)与模型组相比,左旋樟脑组的METTL3的表达量增加;(5)与模型组相比,左旋樟脑组大脑皮质的miR-335表达量明显增加,pri-miR-335的表达量下降;(6)醒脑静注射液有效组份中,左旋樟脑对细胞TIA1表达的促进作用最为明显;(7)与模型组相比,左旋樟脑降低了 OGD/R损伤细胞的凋亡水平、升高了损伤细胞的应激颗粒形成以及增加METTL3的表达量;(8)与模型组相比,左旋樟脑组的miR-335表达量明显增加,pri-miR-335的表达量下降;(9)RT-qPCR实验结果显示,相比较于模型组,左旋樟脑组的RBM3 mRNA表达水平明显升高。western blotting结果显示,相比较于模型组,左旋樟脑组的细胞核RBM3蛋白表达水平明显升高。MeRIP实验显示,相比较模型组,左旋樟脑组的pri-miR-335的甲基化水平有升高。2.通过第二章实验研究发现:(1)脑梗死面积在缺血再灌注24h时最高,于缺血再灌注36h时,有所下降;缺血再灌注6h后,SG形成最为明显,而缺血再灌注24h后SG生成逐渐减少,在缺血再灌注36h后又有所升高;在再灌注后24h,凋亡水平达到峰值,在再灌注后36h时下降。(2)通过侧脑室注射miR-335模拟物以及抑制物,TTC染色结果显示,与模型组相比,模拟物组的梗死体积和行为评分明显下降。(3)通过western blotting以及TUNEL凋亡检测,与模型组相比,miR-335 mimic 组中 ROCK2 和 Caspase-3 active 表达均显著降低,TIA1、Bcl-2表达增加。冷冻切片采用TUNEL染色检测细胞凋亡水平。与模型组相比,miR-335 mimic显著降低缺血脑凋亡水平。(4)免疫组化结果显示,miR-335 mimic较模型组明显促进TIA1表达(P<0.0001)。(5)免疫沉淀法检测大鼠脑皮质组织的TIA1磷酸化水平。与对照组相比,模型和抑制剂组中TIA1磷酸化水平升高。此外,miR-335 mimic组显著抑制TIA1磷酸化水平。(6)双荧光素酶报告基因结果显示,miR-335直接靶向PC12细胞中ROCK2 mRNA的3’ UTR。(7)通过在PC12细胞中转染miR-335模拟物以及抑制物实验发现,miR-335模拟物组与模型组相比,R0CK2表达明显下降,TIA1表达明显升高。免疫荧光染色结果显示miR-335 模拟物明显促进了 SG 的产生。(8)通过 siRNA 抑制 ROCK2 的表达,结果显示与模型组相比,siRNA-ROCK2组的ROCK2表达明显下降,TIA1表达明显升高和SG形成增加。流式细胞术结果显示,与模型组相比,siRNA-ROCK2组细胞凋亡水平明显降低。(9)siRNA-ROCK2组显著抑制了 ROCK2的表达,增加TIA1的表达。siRNA-ROCK2与共转染组在ROCK2和TIA1表达上无显著差异。与模型组相比,共转染组和siRNA-R0CK2组SG形成明显增加,但是两组之间的比较差异无统计学意义;(10)与模型组相比,共转染和siRNA-ROCK2组显著抑制了 ROCK2的表达,两组TIA1表达增加。流式细胞术检测细胞凋亡水平。与模型组相比,共转染组和siRNA-ROCK2组细胞凋亡水平明显下调,两组比较差异无统计学意义。这些结果表明miR-335特异性靶向ROCK2的3’-UTR,从而降低ROCK2表达,促进了 SG形成,抑制细胞凋亡。3.通过第三章实验研究发现:(1)脑梗死面积在缺血再灌注24h时最高,于缺血再灌注36h时,有所下降;(2)缺血皮质凋亡率在缺血再灌注24h时最高,于缺血再灌注36h时,有所下降;缺血再灌注6h后,METTL3表达升高最为明显,随后逐渐降低,在缺血再灌注36h略有上升;(3)mature-miR-335的表达在0h和6h升高,随后逐渐降低在再灌注24小时达到最低值,而pri-miR-335和pre-miR-335表达与mature-miR-335的表达成反比关系,在0h和6h降低,随后逐渐升高;(4)应激颗粒的生成在缺血再灌注6h时被观测到,而其余的时间点均未观测到应激颗粒的生成;(5)实验结果表明,在大鼠MCAO模型中,METTL3表达水平与miR-335的成熟加工成正比关系;(6)实验结果显示,原代皮质神经元细胞以及PC12细胞在OGD/R 0h时应激颗粒生成水平最高,并于0h后逐渐降低;(7)PC12细胞不同糖氧恢复时间的METTL3的western blotting结果显示,METTL3在OGD/R 0h时的表达量最高,随后逐渐降低,在缺血再灌注36h略有上升;mature-miR-335的表达在0h和6h升高,随后逐渐降低在再灌注24小时达到最低值,而pri-miR-335和pre-miR-335表达与mature-miR-335的表达趋势相反,在0h和6h降低,随后逐渐升高;(8)通过流式细胞实验发现PC12细胞在OGD/R 0h时凋亡水平最低,并于0h后逐渐升高;(9)实验结果显示,正常PC12细胞在OGD/R 0h时,其pri-miR-335的甲基化水平最高,并于0h后逐渐降低,在36h时略有升高;(10)METTL3 KO的PC12细胞的mature-miR-335 以及 pre-miR-335 表达表达水平均明显降低,pri-miR-335 的表达水平升高;METTL3 OE的PC12细胞的mature-miR-335以及pre-miR-335表达表达水平均明显升高,pri-miR-335的表达水平降低;(11)METTL3 KO的PC12细胞的pri-miR-335的甲基化水平降低;METTL3 OE的PC12细胞的pri-miR-335的甲基化水平升高;(12)双荧光素酶报告基因结果证实了 miR-335直接靶向PC12细胞中Erf1 mRNA的3,UTR;(13)实验结果显示,与正常对照组相比,转染了 miR-335 mimic的PC12细胞的Erf1蛋白表达明显下降,验证了 miR-335靶向调控Erf1蛋白表达的实验结果;(14)实验结果显示:与正常PC12细胞相比,Erf1沉默的PC12细胞在R0h和R24h时间点的应激颗粒生成水平升高;(15)通过与正常PC12细胞相比,Erf1沉默的PC12细胞在R0h和R24h的凋亡率明显降低;(16)研究结果显示,在PC12细胞进行糖氧剥离刺激6h再恢复糖氧0h后,RBM3与pri-miR-335的相互作用增加,再恢复糖氧24h后相互作用减弱;(17)实验结果显示,OGD/R 0h时RBM3以及METTL3的表达均有升高,而OGD/R 24h时RBM3以及METTL3的表达均有降低。通过蛋白质免疫共沉淀的方法,发现OGD/R 0h时RBM3与METTL3的结合增强,而OGD/R 24h时RBM3与METTL3的结合减弱;(18)通过对大鼠不同组织以及RBM家族蛋白的RT-qPCR实验,结果显示RBM3在大鼠脑皮质中表达较高(略低于心和肝脏组织)。与其他RBM家族蛋白相比,RBM3在MCAO模型大鼠的脑皮质中的表达具有特异性的降低;(19)在PC12细胞中进行RBM3的沉默实验以及过表达实验,western blotting的结果显示沉默以及过表达成功,与正常组相比,RBM3的表达量有明显差异。使用RBM3沉默/过表达的PC12细胞,进行染色质免疫沉淀实验,检测RBM3沉默/过表达后与miR-335启动子区域相互作用的变化,实验结果显示,与RBM3过表达组相比较,RBM3沉默组与miR-335启动子区域的结合明显降低,pri-miR-335的表达水平明显升高,而mature-miR-335的表达水平明显降低。同时本节研究通过MeRIP实验,对各组的pri-miR-335的甲基化水平进行检测,实验结果显示,与正常对照组相比,RBM3过表达组pri-miR-335的甲基化水平明显升高,而RBM3沉默组的pri-miR-335的甲基化水平明显降低。结论:1.miR-335通过调控靶蛋白ROCK2的表达,调节了 TIA1的磷酸化水平,从而促进应激颗粒的生成降低凋亡水平,起到抗急性缺血性中风损伤的作用。2.RBM3与METTL3在细胞核中相互作用促进pri-miR-335的甲基化而影响miR-335的生成。此外RBM3可以与METTL3相结合作用于miR-335的启动子区域,调节pri-miR-335的甲基化水平。3.左旋樟脑增加miR-335的表达促进应激颗粒生成而产生抗急性缺血性中风损伤作用。左旋樟脑促进miR-335生成是通过上调了 METTL3和RBM3的表达,增加pri-miR-335的甲基化水平表达来实现的。