背景：PP2A活性下降导致tau过度磷酸化,进而促进神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)形成,是阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)发病的关键环节。核蛋白SET是体内PP2A特异、高效的抑制剂,主要分布在嗅球、海马、大脑皮质、尾壳核、丘脑等脑区。AD患者经免疫化学检测发现脑内SET表达水平明显增高,而且细胞定位也从细胞核转至细胞浆,并且发现SET共定位于神经元胞浆内PP2A及过度磷酸化的tau蛋白。前期研究发现：过表达SET导致大鼠PP2A活性显著降低,tau异常过度磷酸化,神经元退变,甚至出现AD患者样运动功能障碍的表现。上述研究结果说明：作为PP2A上游调节因子,SET在AD脑内自核转运并滞留于胞浆聚集是引起AD发病的一个非常关键的因素。因此,明确AD脑内SET核运输的具体机理将有助于诠释AD的发病机制。然而SET如何转运并聚积于胞浆内,以及PP2A活性被SET所抑制的具体分子机制尚不清楚。我们前期针对SET核运输相关的核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)序列展开了相应研究,结果发现：Ser-9位点磷酸化失活SET核定位信号,造成核输入蛋白不能正常结合SET,导致SET滞留胞浆。然而,AD患者脑内SET Ser-9磷酸化的分子机制及其它可能致SET滞留胞浆聚集的机制有待进一步明确。14-3-3蛋白作为接头／支架蛋白与其他蛋白质结合,广泛参与了细胞凋亡、细胞分裂、信号转导、蛋白跨膜转运等重要生命活动的调节进程。近来更多的研究揭示了14-3-3蛋白在核运输中的调控作用。比如Cdc25蛋白的Ser-216被磷酸化后可以与14-3-3ε结合形成Cdc25/14-3-3s复合物,并导致Cdc25不能结合importina正常进入到细胞核中,类似的还有RSG, HDAC4蛋白等。这些研究均提示：14-3-3蛋白对于核-浆穿梭蛋白的核输入具有负调作用。同时,14-3-3β/ζ在AD患者脑内过表达,存在于NTFs中,与AD患病进程正相关。这些研究提示：14-3-3β/ζ蛋白参与了AD的病理过程,但具体机制不明。具有核输入负调作用的14-3-3蛋白与其靶蛋白结合存在识别序列RX1-2SX2-3S(X代表基本氨基酸),通过筛选SET的全长,我们发现其1‘‘NESGDPSSKST156序列,符合14-3-3蛋白识别序列RX1-2SX2-3S,提示：14-3-3蛋白可能通过结合SET导致其滞留胞浆,抑制PP2A活性,参与AD发病。本研究证实：14-3-3通过与核输入蛋白importina竞争性结合SET,导致核输入复合物形成障碍,SET入核困难而滞留胞浆,进而引起AD下游病理事件。目的：探讨过表达14-3-3β/ζ对SET核运输障碍的影响及其潜在的分子机制,为AD药物开发提供有效的分子靶点。方法：培养HEK293/tau细胞,转染表达14-3-3β/ζ48h后通过共聚焦／双光子显微镜和WB检测SET的亚细胞分布。通过Co-IP方法检测过表达14-3-3β/ζ组SET与14-3-3β/ζ及核输入蛋白Importina的结合程度。通过筛选SET全长,我们发现其146NESGDPSSKST156序列,符合14-3-3蛋白识别序列RX1-2SX2-3S,为此,合成具有穿膜和透血脑屏障功能的纯化Tat肽段Tat-NESGDPSSKST(Peptide1),和乱序序列作为对照的Tat肽段Tat-NSSTEDGPKSS(Peptide2)。在HEK293/tau细胞转染表达14-3-3ζ的同时加入人工合成并纯化Tat肽段,48h后通过共聚焦／双光子显微镜和WB检测SET的亚细胞分布。通过Co-IP方法检测加入Peptide1/2组是否影响SET与14-3-3p/ζ及核输入蛋白Importina的结合。通过PP2A活性检测试剂盒(Promega, Cat.#V2460)测定过表达14-3-3β/ξ及Peptide1/2干预后对PP2A活性的影响。利用免疫印迹方法检测过表达14-3-3β/ζ,SET,14-3-3β/ζ+SET后对tau蛋白Ser199, Ser202, Thr205,Thr231,Ser262,Ser396和Ser404位点磷酸化程度的影响；人工包装过表达14-3-3ζ的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV),通过腺相关投递系统感染C57小鼠,分别用Peptide1/2干预,进一步明确SET与14-3-3蛋白的结合序列NESGDPSSKST,确定其可能成为促进SET入核的小分子肽,为AD有些药物开发提供候选分子靶点。通过条件恐惧实验,水迷宫实验来检测行为学的变化,激光共聚集荧光显微镜下观察脑片上SET蛋白的亚细胞定位。64位阵列系统检测活体脑片海马DG区到CA1区LTP变化,体外原代培养大鼠胚胎海马神经元检测神经元树突,树突棘等的变化,免疫印迹实验检测小鼠海马synaptotagmin,synaptophysin, synapsin1, phosphorylated synapsin1(p-synapsin1), NR1, NR2A和NR2B等突触蛋白及SET Ser-9磷酸化的变化。结果：在HEK293/tau细胞株中,分别过表达14-3-3β/ζ导致大部分SET自核转运并滞留于胞浆。分别分离提取胞浆及胞核蛋白后,发现过表达14-3-3β/ζ组细胞核内的SET蛋白量明显减少,而在胞浆中明显增加；通过免疫共沉淀方法检测到过表达14-3-3β/ζ；后SET与importina结合减少导致SET核输入障碍。我们还观察到在转染了14-3-3ζ的HEK293/tau细胞株中,用Peptide1处理导致SET正常转运到细胞核中。利用核蛋白提取试剂盒分离提取胞浆与胞核蛋白,发现核蛋白中Peptide1处理组的SET量明显增高,而在胞浆蛋白中明显减少；通过免疫共沉淀方法检测到Peptide1处理组SET与importina结合随剂量逐渐增加。我们还观察到过表达14-3-3β/ζ后显著抑制PP2A活性,并导致tau蛋白在Ser199, Ser202, Thr205, Thr231, Ser262, Ser396和Ser404位点发生过度磷酸化,Peptide1处理可恢复PP2A活性。进一步在小鼠海马齿状回(Dentategyrus,DG)定位注射AAV8-14-3-3ζ病毒感染动物,并用Peptide1/2干预,发现过表达14-3-3ζ后,小鼠情景恐惧实验和水迷宫实验均表现学习和记忆的障碍,而Peptide1处理可以有效恢复。激光共聚集荧光显微镜下观察到脑片中不同区域Peptide1可以恢复过表达14-3-3ζ引起的SET胞浆滞留现象。64位阵列系统检测活体脑片海马DG区到CA1区LTP变化,发现过表达14-3-3ζ可以显著抑制LTP,而Peptide1处理可以有效恢复,体外原代培养大鼠胚胎海马神经元发现过表达14-3-3ζ可导致神经元树突长度缩短,分支减少,树突棘密度减少等变化,而Peptide1处理可以有效恢复,免疫印迹实验检测发现在小鼠海马蛋白中,过表达14-3-3ζ可导致synaptotagmin,synaptophysin,synapsin1,phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)等突触前蛋白减少,NR2A：NR2B比值变大,SET Ser-9,显著磷酸化,Peptide1处理可以有效恢复上述变化。结论：14-3-3β/ζ可以通过与SET蛋白的HESGDPSSKST序列结合,导致SET与importina结合显著减少,从而引起SET核输入障碍,滞留胞浆,显著抑制PP2A活性,并导致tau蛋白发生过度磷酸化,神经元树突损伤,LTP及学习和记忆的损伤。通过给予Tat-NESGDPSSKST肽段可以通过有效竞争性结合14-3-3β/ζ来释放SET,使SET核输入正常而主要定位与胞核,减少对胞浆中PP2A的抑制,恢复PP2A活性,减少神经元树突损伤,恢复LTP及学习和记忆的损伤等。背景：第一部分研究发现过表达14-3-3ζ导致SET滞留在胞浆,并伴有SET Ser-9磷酸化现象。有研究发现SET上游蛋白激酶CKⅡ在AD脑内上调,二聚体的14-3-3ζ可募集CKⅡ。为此,我们设想：14-3-3ζ在结合SET的同时,也俘获CKⅡ,从而使得SET更容易成为CKⅡ的底物被磷酸化,进一步引起磷酸化SET与importina结合障碍,导致SET滞留胞浆。目的：探讨14-3-3ζ与CKⅡ介导SET滞留胞浆的分子机制,进一步阐明AD发病机制。方法：通过海马DG区注射AAV8-14-3-3ζ病毒,感染C57小鼠,激光共聚集荧光显微镜下观察脑片SET的亚细胞定位,以及SET、14-3-3ξ及CKⅡα的分布与共定位。培养HEK293/tau细胞,转染pcDNA3.1+/14-3-3ζ48h后,通过免疫共沉淀方法检测SET、14-3-3ζ及CKⅡα的结合程度。使用CKⅡ特异性抑制剂TBB(4,5,6,7-Tetrabromobenzotriazole)处理转染14-3-3ζ的HEK293/tau细胞,检测SET Ser-9磷酸化变化,SET表达量变化,CKⅡα表达量变化。已转染CKⅡα的HEK293/tau细胞给予sil4-3-3ζ处理,检测SET Ser-9磷酸化变化,SET表达量变化,CKⅡα表达量变化。通过丝氨酸／苏氨酸检测试剂盒(Promega,Cat.#V2460)测定PP2A活性。人工包装过表达CKⅡα的AAV病毒感染C57小鼠,同时分别用AAV8-si14-3-3ζ、AAV8-Ssi处理。通过条件恐惧实验,水迷宫实验来检测行为学的变化,激光共聚集荧光显微镜下观察脑片上SET蛋白的亚细胞定位。64位阵列系统检测活体脑片海马DG区到CA1区LTP变化,体外原代培养大鼠胚胎海马神经元检测神经元树突,树突棘等的变化,免疫印迹检测小鼠海马synaptotagmin, synaptophysin, synapsin1,phosphorylated synapsin1O-synapsin1),NRl, NR2A和NR2B等突触蛋白及SET Ser-9磷酸化的变化。结果：过表达14-3-3ζ的AAV8病毒感染C57小鼠脑片上,我们可以观察到SET、CKⅡα、14-3-3ζ三者间可相互共定位,且过表达14-3-3ζ动物脑内SET主要定位于胞浆。在HEK293/tau细胞株中,免疫共沉淀结果显示SET、CKⅡα、14-3-3ζ三者间相互结合,且过表达14-3-3ζ组的结合程度显著增强。这些结果提示：14-3-3在结合SET的同时,也可募集CKⅡα。已转染14-3-3ζ的HEK293/tau细胞给予CKⅡ抑制剂TBB处理后发现,SET Ser-9磷酸化程度显著降低；给予si14-3-3ζ处理后发现,敲减14-3-3ζ可导致SETSer-9磷酸化程度降低。说明CKⅡα通过14-3-3ζ的募集促进对SET的磷酸化修饰。PP2A活性检测发现TBB处理可很好的恢复由于14-3-3ζ引起的PP2A活性降低。人工包装过表达CKIIa的AAV8病毒感染C57小鼠,同时分别用AAV8-si14-3-3ξ、AAV8-Ssi处理,条件恐惧、水迷宫实验实验发现si14-3-3ξ处理可恢复小鼠学习和记忆能力。激光共聚集荧光显微镜下可观察到过表达CKⅡα可促进SET滞留于胞浆,而si14-3-3ζ可恢复SET的核输入。64位阵列系统检测活体脑片海马DG区到CA1区LTP变化,发现过表达CKⅡα可以显著抑制LTP,体外原代培养大鼠胚胎海马神经元发现过表达CKⅡα可导致神经元树突长度缩短,分支减少,树突棘密度减少等变化；免疫印迹实验检测发现在小鼠海马蛋白中,过表达CKⅡα可导致synaptotagmin, synaptophysin, synapsin1, phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)等突触前蛋白减少,NR2A：NR2B比值变大,SET Ser-9显著磷酸化,si14-3-3ζ处理可以有效恢复上述变化。结论：14-3-3ζ可同时结合CKⅡα与SET,并促进CKⅡα对SET Ser-9的磷酸化,进一步导致SET滞留胞浆,引起PP2A活性抑制、神经元树突损伤、学习和记忆的损伤。si14-3-3ζ显著减少CKⅡα与SET的结合,引起CKⅡ磷酸化SET Ser-9程度降低,从而恢复PP2A活性、神经元树突损伤、学习和记忆的损伤。