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许多细胞在行使生物学功能的过程中,蛋白质的可逆磷酸化属于至关重要的调节机制,蛋白激酶与蛋白磷酸酶分别执行磷酸化和去磷酸化功能,PP1是主要的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶之一。在本论文中,我们将把重心放在研究PP1的催化亚基C的异构体β(Beta)基因(PP-1cβ)。首先,我们采用RACE克隆技术克隆出金鱼β基因的cDNA全长,然后,利用RT-PCR技术分析研究β基因在金鱼不同胚胎时期和不同组织的mRNA水平的表达,最后,我们用Morpholino Oligomers(MO)沉默或构建过表达质粒载体,研究分析PP-1cβ在金鱼胚胎发育的功能。其结果如下:
(1)金鱼中PP-1cβ的cDNA全长1344bp,其中编码区984bp,编码一个含327个氨基酸的蛋白质,预测的分子量约为37.1 kDa。比较氨基酸序列同源性分析表明:该蛋白序列与斑马鱼的同源相似度为96.6%,与小鼠的为97.5%,与非洲爪蟾的为97.8%,与人的为97.5%。其同源性分析表明了β调节亚基的氨基酸序列在不同物种间具备较高同源性,暗示了该基因在功能和进化上具备较高保守性,同时说明PP1-cβ基因在功能上的至关重要性,但其在氨基和羧基末端存在的差异性,则暗示PP1-cβ基因具备了多种不同的重要功能。
(2)经过RT-PCR的分析,证明了在不同组织中的mRNA表达水平上,该基因在大脑中表达为最高,精巢次之,在卵巢、肾、肌肉、心脏、肝五种组织中的表达水平相对较高,鳍、鳃中的表达相对较低。在不同胚胎时期,神经胚时期表达最强,在肌肉效应期中的表达次之,二细胞时期、多细胞时期、囊胚时期、眼色素时期、表达较高,原肠胚时期、视原基时期、脑泡时期、心跳时期、出膜时期表达较低,体色素时期达最低。因此我们推测PP-1cβ基因在金鱼不同组织和胚胎发育的不同时期中可能起到了多种重要的作用。
(3)另外,我们应用显微注射技术,我们将成功构建的PP-1cβ基因过表达载体以及PP-1cβ的Morpholino Oligomers注入到金鱼胚胎里,用来观察金鱼胚胎发育异常。我们观察到注射成功的金鱼胚胎产生了严重的畸形,如胚胎眼睛由于改变其分化模式,从而导致眼睛大小异常,而且由于不均等的细胞分裂与分化,导致金鱼胚胎脊柱弯曲,这更加说明了PP-1cβ对胚胎发育起到了十分重要的作用。接着,利用石蜡切片技术观察了注射成功的金鱼胚胎组织的一系列变化,发现眼睛晶状体和视网膜等主要部位发育畸形,大脑发育畸形等。这样我们可以深入研究该基因对金鱼发育的调节作用。
总之,以上结果为我们在较低等的脊椎动物中探索PP-1cβ基因的具体相关功能奠定了重要的基础。