一、研究背景:脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一种起病急、进展快、严重危及生命的神经科疾病,其发病率和急性期病死率高,有较高的复发率,大多遗留不同程度的神经系统后遗症,如偏瘫和失语等。不仅使患者的生活质量下降,同时也给社会带来沉重的经济负担。因此,对ICH的防治有十分重要的意义,尤其保护中枢神经系统功能,减少神经损伤所致的后遗症更具临床实用性,但目前尚无理想的内科及外科治疗方法。ICH急性期的治疗对疾病转归影响极大,常规治疗局限在脱水、降低颅内压、维持生命体征、对症支持治疗、止血和外科手术治疗等。依达拉奉是一种强效自由基清除剂,能抑制脑水肿,改善神经功能,缓解伴随的神经症状。临床上已广泛应用于治疗缺血性中风,并取得了较好的疗效。依达拉奉可改善缺血脑组织的功能和局部组织结构。大鼠局灶性脑缺血实验表明,依达拉奉可减少缺血和再灌注后脑组织内NO的生成,显著改善神经功能废损症状和减少缺血面积。缺血和出血均可造成局部脑组织氧供减少,引起神经组织损伤。ICH引发的病理过程和缺血类似但又不完全相同,二者均可产生大量的自由基,诱发炎症因子风暴,激活巨噬细胞和小胶质细胞等,促进神经细胞的凋亡。在大鼠和小鼠脑出血模型中均证实依达拉奉可减少脑出血所致的神经细胞凋亡,减轻脑出血后的神经损伤和脑水肿,改善脑组织代谢。但目前有关依达拉奉治疗ICH的相关研究和机制的探索远少于对缺血性脑梗死的报道,具体的分子调控机制和网络尚不清楚,因此,依达拉奉对ICH的临床疗效和作用机理需要更为深入的研究。依达拉奉有多种给药方式,不同的给药途径影响着药效的发挥,如何快速提高靶位的药物浓度是提高疗效的关键。目前,临床主要采用静脉注射或滴注的方式给药,腹腔给药主要应用于动物模型研究,颅内局部给药的方式还未见报道。腹腔给药需经过肠系膜吸收后才能入血,这一过程会导致药物的损耗,使进入血液的药物减少。静脉输液和动脉推注,可不经肠壁和肝脏直接进入体循环,比腹腔给药途径可获得更快更高的血药浓度。但药物必须通过全身血液循环后才能最终到达病变部位,这种途径给予的药物是全身分布的,真正作用于病变部位的药物仅占所给药物的小部分。而且高浓度的依达拉奉随血流可分部到全身的任何组织,因此也增加了发生不良反应的机率。另外,静脉注射同时受到穿刺的局限,部分患者的静脉不易寻找,特别是肥胖病人更加困难。鉴于此,需要寻找一种更有效的给药途径以提高疗效,减少副作用。立体定向给药目前被认为是一种较好的给药方式,特别适于颅内少量出血进行立体定向微创手术治疗或保守治疗需要局部给药的病人,它避免了经血的长时间长距离的运送,也不用再受血脑屏障的影响。立体定向给药是否优于其它的给药途径?经立体定向给药的依达拉奉通过什么机制改善神经功能?这些都是本文需要解决的问题。二、研究目的(1)观察立体定向注射依达拉奉对脑出血大鼠的神经保护作用。(2)观察立体定向注射依达拉奉对免疫炎症反应和细胞凋亡的调节作用。(3)对比不同给药途径的依达拉奉疗效差异。三、材料和方法:第一部分立体定向注射依达拉奉对脑出血大鼠的神经保护作用实验建模和分组:本研究选用201只体重在250-280g的成年sd大鼠(雄性),利用注射vii型胶原酶的方法构建ich大鼠模型。实验分为四组:假手术组,ich生理盐水立体定向对照组,依达拉奉腹腔给药组,依达拉奉立体定向给药组。生理盐水立体定向对照组:出血灶形成后24h、72h,立体定向注入血肿腔10μl生理盐水。腹腔给药组:出血灶形成后1h、24h,48h,72h腹腔注射3mg/kg的依达拉奉。立体定向给药组:出血灶形成后24h、72h立体定向注入血肿腔10μl,1.5mg/ml的依达拉奉。评价指标:(1)神经功能评估:对四组大鼠在不同时间点进行神经行为学评分(mnss评分);(2脑出血损伤范围:mri扫描后三维重建计算血肿体积和出血侧的脑室体积用以评价损伤程度;he染色评价脑损伤形态学,(3)神经纤维再生:快蓝染色及nf200免疫荧光染色观察髓鞘再生及轴突再生;(4)胶质瘢痕形成:采用gfap免疫荧光染色观察胶质瘢痕的形成。统计学分析:所有数值型原始数据用均数±标准差(sd)表示,组间差异采用单因素方差分析进行统计。造模后各组大鼠各时间点的数据比较用重复测量的广义线性模型分析,单个时间点间数据比较用one-wayanova分析,组间的多重比较采用bonferroni进行多重检验校正。均为双侧检验,α=0.05,以p<0.05为差异有统计学意义的判断标准。所有统计均使用spss21.0统计软件处理,采用prism6.0进行绘图。第二部分立体定向注射依达拉奉对脑出血大鼠炎症水肿反应和细胞凋亡的调节实验分组和建模:同第一部分。评价指标:(1)炎症水肿反应:1)脑水肿反应:检测脑组织干湿重比;2)血脑屏障破坏程度:伊文思蓝染色(evansblue)和透射电镜观察;3)小胶质细胞极化现象:荧光双标记物染色(inos/cd11b、arginase-1/cd11b),同时用wb从蛋白水平进一步验证小胶质细胞向m1和m2的分化程度;4)炎症因子表达:elisa定量检测脑组织中炎症因子(tnf-α、il-1β、il-4和il-10)的表达水平。(2)细胞凋亡的研究:1)检测mda含量,以缺口末端标记法(tunel法)检测神经细胞凋亡数;2)免疫荧光染色分析caspase-3、bcl-2等凋亡相关蛋白的表达变化。统计学分析:同第一部分。四、结果1.依达拉奉治疗组(依达拉奉立体定向给药组和依达拉奉腹腔给药组)的行为学评分在1.5天后显著低于生理盐水立体定向对照组(p<0.05),而且依达拉奉立体定向给药组的行为学评分在给药7天后显著低于依达拉奉腹腔给药组(p<0.05)。2.依达拉奉治疗组脑出血mri显示第28天依达拉奉立体定向治疗组损伤的脑组织体积显著小于腹腔注射组和生理盐水对照组(p<0.05)。ich出血灶he染色显示第7天和第14天时,依达拉奉立体定向治疗组出血灶体积相比于立体定向盐水对照组与依达拉奉腹腔注射治疗组有明显的缩小趋势。3.依达拉奉治疗组神经髓鞘(fastblue)染色及神经轴突nf200免疫荧光染色显示依达拉奉立体定向给药组与盐水立体定向组和腹腔给药组相比,7天和14天髓鞘缺失面积明显减小(p<0.05),nf200表达显著增高(p<0.05)。神经胶质瘢痕gfap免疫荧光染色显示,依达拉奉立体定向给药组与其它两组比,gfap表达显著降低(p<0.05)。4.依达拉奉治疗组血脑屏障通透性(伊文思蓝染色)和干湿重比在5天时均显著优于和小于生理盐水立体定向对照组(p<0.05),依达拉奉立体定向给药组和依达拉奉腹腔给药组两组间也存在显著性差异(p<0.05)。透射电镜观察血脑屏障星形细胞足突显示依达拉奉治疗组在ich第14、28天水肿显著小于其它两组。5.小胶质细胞分型标志物荧光染色显示Arginase-1标记物(抑炎M2型)高表达,iNOS标记物(促炎M1型)低表达;WB相对定量实验显示第7和14天时,依达拉奉治疗组与生理盐水立体定向对照组相比,Arginase-1表达显著升高,iNOS表达显著降低(P<0.05)。6.依达拉奉治疗组(依达拉奉立体定向给药组和依达拉奉腹腔给药组)TNF-α和IL-1β表达量显著低于生理盐水立体定向对照组(P<0.05),IL-4和IL-10表达量显著高于盐水立体定向对照组(P<0.05)。与依达拉奉腹腔给药组相比,依达拉奉立体定向给药组的TNF-α和IL-1β表达量显著降低,IL-4和IL-10表达量显著升高(P<0.05)。7.在第7天时,依达拉奉治疗组Caspase-3蛋白表达下调,Bcl-2蛋白表达上调,细胞凋亡计数显著低于生理盐水立体定向对照组(P<0.05)。8.依达拉奉立体定向注射过程中未观察到有大鼠死亡,也没有抽搐、感染等其它并发症发生。五、结论本研究发现依达拉奉立体定向局部给药途径治疗效果显著好于腹腔注射给药途径的治疗效果。立体定向注射依达拉奉可显著改善脑出血大鼠的神经功能废损,其机制主要与其神经保护功能、抗炎症反应以及抗凋亡作用有关。本研究为临床使用依达拉奉治疗脑出血提供了理论基础,为临床使用依达拉奉的治疗途径提供了新的思路。