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目的:原发性肝癌是威胁人类健康的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率分别占全部恶性肿瘤的第6位和第4位。我国是肝癌大国,其新发病例和死亡病例均占全球总数的一半以上。但肝癌对化疗药物敏感性较差,且易产生耐药性,极大的限制了化疗的应用。肝癌耐药的发生机制复杂,从接受化疗药物刺激信号到肿瘤细胞内发生一系列信号通路传导,上调一些促进存活的基因和促进药物泵出的基因表达,产生对化疗药物的耐受。在这一过程中,肿瘤细胞在化疗药物刺激下的抗凋亡机制发挥着重要作用。SND1(Staphylococcal Nuclease And Tudor Domain Containing 1)蛋白是一个进化上高度保守的多功能蛋白质,可作为转录共激活因子、RISC(RNA-induced Silencing Complex)复合物成员等促进肝癌的发生发展。近年来有研究表明SND1蛋白参与肿瘤的抗凋亡机制,且在非小细胞肺癌的化疗抵抗中发挥重要作用。但SND1蛋白在肝癌的化疗抵抗中发挥的作用尚无报道。因此本课题旨在深入探讨SND1蛋白与肝癌的相关性,及在肝癌细胞受到化疗药物刺激时的抗凋亡机制。方法:本课题主要分为三部分:第一部分:(1)检索人类蛋白图谱(The Human Protein Atlas,HPA)网络数据库中肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)组织化学样本,分析SND1蛋白在HCC癌与癌旁的蛋白水平差异;(2)检索癌症和肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库,下载并整理HCC患者临床信息和表达谱信息数据集,分析HCC癌和癌旁中SND1基因的表达差异;(3)针对患者一般临床资料(性别、年龄、人种、种族)和HCC的TNM恶性肿瘤分期(TNM Classification of Malignant Tumors)、组织学病理分级(Grading)及巴塞罗那分期(Staging)对下载的数据进行亚分组,分析SND1的表达水平与上述分组指标之间和患者总生存率之间的相关性。第二部分:(1)利用流式细胞术、蛋白质印迹技术(Western Blot,WB)等实验手段来研究干扰SND1表达的HCC细胞系在正常培养状态下(肿瘤正常生长)以及化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)或顺铂(Cisplatin,CPT)刺激下(肿瘤接受化疗治疗)的凋亡状况,明确SND1在HCC凋亡中的作用;(2)通过RNA芯片(RNA Microarray)、荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR)的方式寻找HCC在化疗药物处理之下SND1蛋白的下游靶基因;(3)通过流式细胞术探讨SND1-LncRNA UCA1(Urothelial Cancer Associated 1)轴在HCC细胞接受化疗药物5-Fu刺激的凋亡机制;(4)通过裸鼠皮下成瘤联合腹腔给药治疗实验,在动物水平上探究SND1-UCA1轴的抗凋亡功能。第三部分:(1)通过分泌型荧光素酶基因报告系统(Secreted and robust Gaussia Luciferase gene reporter system,GLuc)确定SND1对LncRNA UCA1启动子作用的具体区域;(2)通过JASPAR在线预测网站对LncRNA UCA1启动子进行转录因子预测,再通过STRING蛋白质网络分析数据库和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)实验找出与SND1蛋白结合的激活UCA1的转录因子;(3)通过GLuc实验和凝胶迁移电泳(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)实验分析MYB在LncRNA UCA1启动子的具体作用区域;(4)通过染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation Assay,ChIP)实验明确SND1和MYB在UCA1启动子区的结合方式。结果:第一部分:(1)HPA数据库的免疫组化结果显示SND1蛋白在正常肝组织中染色较浅,而在HCC中呈现深染;(2)针对TCGA数据库收录的HCC数据集进行分析,发现SND1基因处在高表达区,且具有显著差异(癌与癌旁数据相比);(3)无论是以患者一般临床资料(性别、年龄、人种、种族)分组,还是以TNM分期、组织学病理分级及巴塞罗那分期分组,均未发现SND1的表达水平与上述分组指标和患者总生存率存在显著相关性。第二部分:(1)单纯干扰SND1的表达并不会影响HCC细胞系的凋亡水平,但是与SND1正常表达的细胞相比,干扰SND1表达的HCC细胞在受到化疗药物5-Fu或CPT处理后,其凋亡水平明显增加,凋亡相关蛋白BAX/Bcl-2的比例明显升高;(2)使用6μg/mL 5-Fu处理细胞,发现与SND1正常表达的细胞相比,干扰SND1后一系列基因发生上调或下调的变化,选择LncRNA UCA1作为研究对象;(3)使用6μg/mL 5-Fu处理细胞,发现与正常细胞相比,干扰UCA1后HCC细胞发生凋亡的比例增加,但在干扰SND1的基础上回复LncRNA UCA1的表达后,细胞的凋亡水平有所降低(与干扰SND1的细胞相比);(4)与HepG2-shNC对照细胞所成瘤体相比,HepG2-shSND1-#1和HepG2-shUCA1-#1的瘤体明显减小,而HepG2-shSND1-#1+UCA1的瘤体可回复至与对照细胞相似的瘤体。第三部分:(1)SND1可激活UCA1启动子区-2000 bp至转录起始位点(Transcription Starting Site,TSS)的各个片段,主要作用位点集中在-500 bp~TSS的核心启动子区;(2)JASPAR预测出近200个转录因子,但STRING数据库显示只有转录因子MYB与SND1存在潜在结合关系,使用SND1抗体富集SND1蛋白,可以钓到MYB;(3)与之相似,MYB可激活UCA1启动子区-2000 bp至转录起始位点的各个片段,主要作用位点集中在-500 bp~TSS的核心启动子区,EMSA实验确定MYB可结合到UCA1启动子区-231~-222 bp位置;(4)ChIP结果显示SND1可结合到UCA1启动子区-231~-222 bp位置,而SND1敲低可影响MYB在UCA1启动子区-231~-222 bp位置的结合。结论:(1)SND1在HCC中高表达,但SND1的表达水平与患者生存率之间并无明显差异。(2)干扰SND1或LncRNA UCA1的表达可增强HCC对化疗药物5-Fu的敏感性,增加HCC细胞的凋亡水平,而干扰SND1同时回复LncRNA UCA1的表达可抵消因干扰SND1产生的5-Fu诱导HCC凋亡水平增加。(3)SND1通过与转录因子MYB结合,共同激活LncRNA UCA1的表达,在HCC抵抗化疗药物致凋亡的过程中发挥作用。