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鸡蛋作为一种重要的膳食原料,产出后在运输、贮存、加工及消费的过程中均会受到不同程度的微生物污染。鸡蛋蛋壳表面的微生物会造成一定的危害,首先,鸡蛋蛋壳表面的微生物直接对人体的健康构成严重的威胁;其次,在食品的加工过程中,蛋壳表面的微生物易与其他食品产生交叉污染,这是引发食源性疾病的原因之一;最后,蛋壳表面的微生物会侵入蛋内,从而造成蛋的细菌性腐败变质。因此,建立快速、准确的鸡蛋蛋壳表面细菌总数的检测方法对控制蛋壳表面微生物的潜在危害具有非常重要的意义。本研究旨在建立MTT 比色法和ATP生物发光法这两种快速检测细菌总数的方在食品安全领域实现微生物的实时监测提供现实的指导。其主要的研究内容和研究结果如下:1.MTT比色检测细菌总数的方法的建立由于MTT 比色法生成的甲瓒结晶体不法,并将其用于鸡蛋蛋壳表面细菌总数的检测,为MTT 比色法和ATP生物发光法溶于水,因此一般将MTT 比色实验分为MTT还原反应阶段即甲瓒结晶体的生成阶段和甲瓒结晶体的溶解阶段。在甲瓒结晶体的溶解阶段,分别对溶解剂的种类和溶解时间进行了优化;在MTT还原反应阶段,分别对MTT的添加量、反应体系的pH值、温度和反应时间进行优化,建立最适的MTT 比色检测细菌总数的方法。实验结果表明:在甲瓒结晶体的溶解阶段,碱性溶液与DMSO的混合液对甲瓒结晶体的溶解效果较好,确定甲瓒结晶体的溶解剂为32 mMNaOH与DMSO的混合液,两者的体积比为1/9,选择的甲瓒结晶体的溶解时间为20 min;在MTT还原反应阶段,最适的MTT(5g/L)试剂与样品的体积比为4/100,反应体系的最适pH值为8,反应时间为4 h,并且证明死菌体不会对实验结果造成影响。2.ATP生物发光检测细菌总数的方法的建立本项研究分别对反应体系的影响因素,萤火虫荧光素酶的稳定性及细菌细胞内ATP的提取方法进行了研究。实验结果表明:首先,在反应体系的优化实验中,确定浓度为60 mg/L荧光素和浓度为70 mg/L萤火虫荧光素酶为底物与酶的最佳浓度组合,反应体系中Mg2+的最适作用浓度为18.75 mM、最佳的pH值为7.50、温度为25-30℃;其次,在酶的稳定性研究中,确定含有浓度为7g/L的BSA、0.75 mM GSH及160 mMDTT的萤火虫荧光素酶稀释液为酶的保存液;最后,在细菌细胞的ATP提取研究中,确定浓度为0.2 g/LBAB的提取效果最好,同时证明DEAE-Dx能够在一定程度上清除残留的ATP提取剂对发光反应的抑制作用,且在DEAE-Dx的浓度为0.4%时效果最好。3.应用MTT比色法和ATP生物发光法检测鸡蛋蛋壳表面的细菌总数实验室前期研究结果表明,鸡蛋蛋壳表面优势菌株由59.57%的葡萄球菌属、25.62%的杆菌属以及其他菌属组成。在此基础上,将沙门氏菌(Salmonella enterica)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25923)混合,使其浓度比为1:3:6,并以此为鸡蛋蛋壳表面微生物的模型,建立MTT比色法和ATP生物发光法的工作曲线。实验结果表明:MTT比色法所测得的吸光度与模拟菌液的细菌总数呈正相关,且检测限为5.2×105 cfu/ml;ATP生物发光法所测得的发光强度的对数值与模拟菌液的细菌总数对数值呈正相关,且检测限为9.5 × 104 cfu/ml;MTT比色法和ATP生物发光法所测得的鸡蛋蛋壳表面细菌总数的结果与平板计数法的实验结果均无显著差异。因此,建立的MTT比色法与ATP生物发光法能够用于鸡蛋蛋壳表面微生物的检测。