多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是在环境中广泛存在的一类具有难降解性,致畸性,致癌性以及致突变性的有机污染物(Persistant Organic Pollutants,POPs)。该类有机污染物可长期积累并存在于土壤环境中,对土壤的生态功能,农作物的生产质量以及人类的健康具有严重的危害。因此,修复土壤多环芳烃的污染,保护土壤环境安全,并且可持续利用土壤资源是当前各国关注的热点。生物修复当今最具潜力而且对环境破坏最小的土壤修复技术之一,是利用植物与微生物的协同作用降解有毒有机污染物的多元复合修复技术。豆科植物——根瘤菌共生体系具有生物固氮的功能,在有机污染土壤中碳素含量过高,氮素相对缺乏的情况下,利用该生物共生体系对污染土壤修复具有积极意义。因此,研究豆科植物——根瘤菌共生体系修复多环芳烃在根际环境中的降解作用机理以及其根际响应机制,可以为制定高效实用的土壤多环芳烃污染修复技术提供基础性的研究数据和针对性的防治办法。本文选择菲(PHE)和芘(PYR)为代表性的多环芳烃,从多环芳烃降解菌的筛选,降解基因的扩增与鉴定,降解菌对多环芳烃的降解率测定,根际微生物结构分析、根系分泌物的作用等多角度开展了豆科植物豇豆修复PHE污染土壤的根际响应机制研究;采用植物实验结合PCR技术、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和磷酸脂肪酸分析(PLFA)技术等分析不同根系微域的菌群变化。采用高压液相色谱(HPLC)和放射性同位素衰变技术分析多环芳烃PHE的降解及矿化速率。主要研究结果如下:(1)在高效PAHs降解菌的筛选试验中,通过对长期污染土壤中的菌群进行多环芳烃PHE、PYR的液体富集培养,通过初筛复筛得到111株PHE、PYR降解菌。其中有43株可降解PHE,15株可降解PYR,27株PHE和PYR都能降解,14株可在PHE平板生长,但没有降解圈,3株可在PYR平板生长没有降解圈,9株可以在PHE、PYR平板同时生长但也没有降解圈。从111株降解菌中挑选42株代表菌进行ERIC-PCR,对其指纹图谱进行聚类分析,共聚成10大类群。(2)在鉴定高效多环芳烃降解菌及降解基因试验中,对从长期污染土壤中筛选得到的17株代表菌进行测序并构建系统发育树,结果证明17株菌分别聚成7大类群,从七大类群中各选出一株代表菌株进行研究,确定了七株代表菌的分类地位,这七株菌分别命名为Mycobacterium vanbaalenii USACA0001-A3,Mycobacterium gilvum USACA0002-B4,Pseudonocardia carboxydivorans USACA0003-C9,Delftia tsuruhatensis USACA0004-D17,Achromobacter xylosoxidans USACA0005-E1,Pseudomonas aeruginosa USACA0006-F15,Bacillus cereus USACA0007-G6。利用已报道的降解基因的引物进行同源扩增,分别从Delftia tsuruhatensis USACA0004-D17、Pseudonocardia carboxydivorans USACA0003-C9中获得多环芳烃双加氧酶基因。序列分析表明,D17的降解基因片段(721bp)与Pseudomonas putida所编码的双加氧酶metapyrocatachase catechol 23-dioxygenase具有100%的相似度。C9同源扩增的多环芳烃降解基因(320bp)与Nocardioides sp.的编码铁硫蛋白大小亚基的phd A,phd B基因具有98%的相似度。本文为首次研究C9 Pseudonocardia carboxydivorans和D17 Delftia tsuruhatensis的PAHs降解基因。(3)在高效多环芳烃降解菌的筛选及降解率分析试验中,通过平板升华法对7大类群中的代表菌株进行降解率初步测定,形成透明圈的速率为:D17>A3>C9>B4>E1>F15>G6。通过比较降解速率,从中选择3株降解率最高的菌株A3、C9、D17通过液体培养法,采用高效液相色谱法HPLC技术对该菌株PHE降解率进行研究。结果表明,在30℃震荡液体培养条件下,菌株D17在72 h内对100 mg/L的PHE降解率为94.4%。A3、C9的降解率分别为85.5%,81.4%。菌株D17的最适生长条件为30℃,p H=7.0。(4)在实验室新污染土壤与实际情况下长期污染土壤对于多环芳烃生物修复过程差异效应的对比试验中,选择7种典型的PAHs(Naphthalene,Phenanthrene,Pyrene,Acenaphthene,Anthracene,Chrysene,Benzo[α]pyrene)作为目标污染物,选择长期污染土壤HS和新污染土壤NS作为研究对象,通过富集驯化培养,运用PCR-DGGE技术,对比长期污染土壤和新污染土壤中7种不同PAHs降解菌群的差异和变化,同时跟踪测定降解菌群生物表面活性剂产生情况。结果表明,在不同的PAHs处理下,长期污染土壤HS较新污染土壤NS表现出更高的菌群的多样性。通过PCR对BPHD Biphenyl dioxygenases进行同源扩增,在HS7,HS8,NS7,NS8处理中成功扩增出目的序列,其同源性与Rhodococcus sp.编码的biphenyl 2,3-dioxygenase alpha亚基的(bph A1)基因相似度为98%。对富集培养发酵液中的生物表面活性剂进行提取纯化,并对其水溶液的表面张力进行测定。最低的表面张力为32.5m N m-1。微生物菌群利用高环PAHs如B[α]p和混合PAHs的过程中,可以产生生物表面活性剂以促进高环PAHs的吸收降解。(5)在优势豆科植物——根瘤菌共生体系筛选试验中,选用九种代表性的豆科植物做为生物联合修复研究对象,测定其在石油污染土壤、多环芳烃污染土壤中的耐受性生存率、生物量、结瘤数等指标,豇豆在高浓度有机污染处理中表现出了较高的生存率和结瘤量,较其他豆科植物表现出了较高的生物量与耐受性。因此,豇豆作为模式植物用于构建豆科植物——根瘤菌共生体系。(6)在PAHs新污染土壤与PAHs长期污染土壤生物修复机制的研究试验中,选用豇豆(Vigna unguiculata)作为研究载体,并且设置接种根瘤菌的处理,对比其在两种不同类型土壤中的生长指标,研究根瘤外部形态和内部显微结构的差异。并且通过HPLC测定有无根瘤组织对于PAHs衰减的影响。通过DGGE分析共生体系四部分微域(非根际微域、根系表面微域、根瘤表面微域和根瘤内部微域)对PHE的菌群响应。通过研究表明:在新污染土壤中种植的豇豆根瘤外部形态和显微结构接近正常根瘤。而在长期污染土壤中种植的豇豆根瘤外部形态成黑褐色,显微结构与正常根瘤结构具有明显差异。通过HPLC的测定,发现保留正常根瘤组织的豇豆在PHE和PYR衰减试验中的降解率均高于去除根瘤组织的处理。通过平板升华法观察到,根系表面微域和非根系土壤微域均有多环芳烃降解菌存在,在有多环芳烃的处理中,根瘤表面微域和根瘤内部微域同样出现多环芳烃降解菌。而在没有添加多环芳烃的对照处理中,根瘤内部和根瘤表面微域无多环芳烃降解菌。通过对豆科植物——根瘤菌共生体系四部分特殊微域的PHE降解菌进行DGGE分析发现,根系表面微域和非根际土壤微域相比与根瘤表面微域和根瘤内部微域来说,具有更多样化的PHE降解菌。根瘤内部亦存在多环芳烃降解菌。除多环芳烃降解菌外,还存在其他菌种虽然对于多环芳烃没有直接降解能力,但是能产生生物表面活性剂,或是根际促生菌。长期污染土壤比新污染土壤具有更高的降解菌群多样性。(7)在多环芳烃PHE对三种表现型的豇豆种子的生态毒性效应试验中,选择三种不同表现型的豇豆品种(C1:有大量根系粘液层C2:有少量根系粘液层C3:无根系粘液层),研究不同浓度梯度的多环芳烃PHE(0 mg L-1,50 mg L-1,100 mg L-1,300 mg L-1,500 mg L-1)对三种豇豆种子的发芽与根伸长抑制生态毒性。结果表明,不同浓度多环芳烃PHE对于三种豇豆种子的发芽率均无影响,所有品种均100%萌发。但在15天培养期内,对三种豇豆类型种子的根伸长抑制率,茎伸长抑制率以及发芽指数有明显差异。总体趋势随着PHE浓度的升高,影响程度越大。在低浓度的PHE存在下,对个别豇豆类型如C1的根、茎伸长具有促进作用。不同浓度的多环芳烃PHE对于根伸长的影响大于对茎的影响。豇豆C1品种种子萌发过程对PHE表现出较大的耐受性,其原因可能与根部粘液层的分泌有关,需进一步研究。(8)在豇豆(Vigna unguiculata)根系粘液层对于生物修复多环芳烃污染土壤机制的研究中,采用三种相同生物型,不同表现型的豇豆品种(1)C1:有大量根系粘液层(2)C2:有少量根系粘液层(3)C3:无根系粘液层作为研究对象,分析豇豆产生的根系粘液层对于污染的土壤中PHE降解效果的影响。通过比较其在相同PHE浓度条件下的生长情况,测定各项生物指标并运用方差分析其显著性。通过根系影印试验直观观察分析根系粘液物质对于PHE降解的影响。运用HPLC技术对土壤中PHE的降解率进行测定,从而比较三种表现型豇豆品种对于PHE的修复效率。对根系粘液层物质进行放射性同位素14C标记的14C-PHE矿化率试验,从而直接分析根系粘液层物质对与PHE矿化作用的影响。结果表明,豇豆C1在各项生物指标中均表现出生长优势,尤其在结瘤量方面较其他处理显著。说明豇豆C1在多环芳烃污染环境中能够保持良好的生理功能,具有较高的抗逆性。可作为模式植物用于生物修复土壤的多环芳烃污染。根系分泌的粘液物质对于PHE降解圈的形成和扩大起到了促进作用。说明根系粘液物质有助于根际微生物对于PHE的降解。接种了根瘤菌的豇豆C1处理(SHS+C1+R)对于PHE的降解效果最为显著,降解率达到91.6%。而未种植豇豆的对照处理的降解率仅为48.4%和51.2%。豇豆C2、C3的处理无论是否接种根瘤菌对于PHE的降解差异不显著。通过降解率试验,豇豆C1类型比C2、C3类型对于土壤中PHE的降解率明显提高,表明豇豆C1类型在生物修复的应用上作为模式修复植物比C2、C3具有更加明显的优势。在放射性同位素14C标记的14C-PHE矿化率试验中,经过20天的培养周期,添加了根系粘液物质的土壤处理的矿化率比未添加根系粘液物质的对照处理高12.0%。但是,纯菌Delftia tsuruhatensis USACA0004-D17处理的矿化率曲线与土壤处理的矿化率曲线略有不同,呈现先抑制后促进的趋势。在第20天D17+RM测定的结果比D17处理的矿化率高8.8%。表明根系粘液层促进了14C-PHE的矿化作用。(9)植物分泌的根系粘液层对于PAHs污染土壤中微生物种群的多样性的影响迄今为止可以说是一个前人未涉及的领域,在生物修复研究中具有重要的意义。本试验采用磷酸脂肪酸分析法(PLFA)分析土壤微生物群落结构,通过PCR-DGGE技术对比各处理根际土壤和非根际土壤的PAHs降解菌多样性。并运用主成分分析(PCA),神经网络分析(ANN)等手段对数据结构进行处理。DGGE结果表明:在生物修复过程中存在大量的不能直接降解PAHs的菌群,如根际促生菌、生物表面活性剂产生菌等,与PAHs降解菌共生,通过协同作用促进难溶有机物PAHs的降解。根际土壤比非根际土壤的PHE降解菌多样性程度更高,而且根瘤菌的加入促进了根际PHE降解菌的多样性,豇豆C1的根系粘液层的产生对于土壤中的PHE降解菌的生长具有积极作用。PLFA结果表明:豇豆C1根系粘液层的产生对土壤中微生物总量的变化不明显,但是引起土壤中微生物种群结构的变化,豇豆C1与PLFA中的真菌生物量具有相关性。PHE的添加与GP/GN比率具有相关性。根瘤菌的添加对于土壤总菌群数量与结构的影响不明显。