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背景与目的心肌缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury,IRI）常见于心肌梗死、心肺复苏、冠脉介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI）、体外循环下心血管大手术等,长期缺血心肌在恢复血流灌注的同时,可能导致心肌损伤进一步加重。尽管已有大量研究以IRI发生机制的不同环节为靶点,研究开发防治缺血后心肌损伤的方法,但目前临床上仍缺乏公认有效的心肌保护策略。瞬时受体电位香草酸亚型1（transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1）是一种伤害性感受分子,可被一系列伤害性刺激所激活,在动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭、血管重塑等心血管疾病中发挥重要作用,已成为心血管疾病防治和药物研发的重要靶点。溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,LPA）是细胞膜磷脂代谢的中间产物,可在组织损伤或坏死过程中大量释放。LPA可直接结合大鼠TRPV1通道C-末端710位点上的赖氨酸（Lys,K;小鼠为K711）,诱发急性疼痛。目前研究LPA在缺血性心脏疾病中的作用与机制大多数是关于其与LPA受体结合,国内外尚无LPA与心脏TRPV1受体相互作用参与缺血后心肌损伤的报道。因此本研究主要探讨LPA是否与心脏TRPV1受体相互作用介导心肌缺血再灌注损伤,旨在为围术期心肌损伤的防治提供理论依据和治疗靶点。方法1.LPA在小鼠离体心脏缺血再灌注损伤中的作用将C57BL/6小鼠随机分为4组,每组9只:假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（IR组）、IR+LPA组、IR+HA130组。通过Langendorff装置建立小鼠离体心脏IRI模型,Sham组心脏持续灌注110 min;IR组心脏稳定20 min后,全心停止灌注30 min后再灌注60 min;IR+LPA组在IR基础上给予外源性LPA（10μmol/L）;IR+HA130组在IR前10 min腹腔注射LPA抑制剂HA130（1μL/g,1m M）。TTC染色测定心肌梗死体积,ELISA法测血清及冠脉流出液LPA浓度,LDH试剂盒检测冠脉流出液中LDH水平,Western blot测定心肌组织p TRPV1/TRPV1及Bcl-2/Bax表达。2.TRPV1抑制肽V1-cal对LPA介导心肌缺血再灌注损伤的影响人工合成小分子多肽V1-Cal（YGRKKRRQRRRGSGRAITILDTEKS）及其对照肽TAT（YGRKKRRQRRRGSG）,该多肽模拟TRPV1受体的TRP结构域序列,而TRP结构域是决定TRPV1通道开放的关键结构。将C57BL/6小鼠随机分为3组,每组6只:V1-cal+IR组、TAT+IR组、IR+LPA+V1-cal组,建立全心IRI模型。IR+V1-cal组、IR+TAT组在IR基础上给予外源性V1-cal（1μmol/L）和TAT（1μmol/L）;LPA+V1-cal+IR组在IR基础上同时给予外源性V1-cal（1μmol/L）和LPA（10μmol/L）。TTC染色测定心肌梗死体积,LDH试剂盒检测冠脉流出液中LDH水平。3.TRPV1受体的Lys711位点突变对心肌缺血再灌注损伤的影响通过CRISPR/Cas9技术构建TRPV1K711N点突变小鼠,将711位点赖氨酸（K,Lys）突变为天冬酰胺（N,Asn）。将野生型（WT）和TRPV1K711N小鼠分为四组,每组6只:WT+Sham组、WT+IR组、TRPV1K711N+Sham组、TRPV1K711N+IR组,建立小鼠离体心脏IRI模型。TTC染色测定心肌梗死体积,LDH试剂盒测冠脉流出液中LDH水平,电镜下观察线粒体肿胀程度。分离WT和TRPV1K711N小鼠心肌线粒体,以LPA诱导线粒体肿胀,观察两组小鼠线粒体对LPA的反应。结果1.LPA可加重小鼠离体心脏缺血再灌注损伤与Sham组相比,IR组出现明显心肌梗死,冠脉流出液中LDH水平及LPA水平升高,且LPA水平与心肌梗死体积成线性相关;心肌组织p TRPV1及TRPV1蛋白表达增加,Bcl-2/Bax比值降低。与IR组相比,IR+LPA组心肌IRI加重,p TRPV1和TRPV1蛋白水平均升高;相反,IR+HA130组心肌IRI和p TRPV1、TRPV1水平得到逆转。以上提示,LPA介导离体心脏缺血再灌注损伤,其作用与激活TRPV1信号有关。2.TRPV1抑制肽V1-cal阻断LPA介导的心肌缺血再灌注损伤在全心缺血前和再灌注前给予TRPV1抑制肽V1-cal,可减轻IRI引起的心肌梗死;同时灌注V1-cal和LPA后,心肌梗死体积减小,再灌注后冠脉流出液中LDH水平下降。提示V1-cal可阻断LPA与TRPV1受体结合,从而减轻LPA介导的心肌缺血后损伤。3.TRPV1受体K711N位点突变减轻心肌缺血再灌注损伤和LPA诱导的线粒体肿胀利用CRISPR/Cas9技术成功构建TRPV1K711N点突变小鼠,DNA测序确认基因型。与WT小鼠相比,TRPV1K711N小鼠经历IRI后心肌梗死体积减小,冠脉流出液中LDH水平降低,电镜下观察发现TRPV1K711N小鼠IRI后线粒体肿胀程度减轻。两组小鼠心肌线粒体同时加入LPA刺激后,WT小鼠心肌线粒体在540 nm处吸光度明显下降,表明线粒体发生肿胀;而TRPV1K711N小鼠线粒体肿胀程度减轻。结论小鼠离体心脏IRI引起LPA水平升高,后者可通过活化TRPV1受体加重心肌缺血后损伤;TRPV1抑制肽V1-cal能够阻断LPA与TRPV1受体的结合区域,显著减轻LPA介导的心肌IRI;TRPV1受体K711N位点突变可以阻断LPA与TRPV1的作用位点,从而减轻心肌IRI和LPA介导的线粒体肿胀。