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猪传染性胃肠炎(TGE)是由TGEV感染引起的一种高度接触性传染病。TGEV感染引起肠屏障功能障碍并破坏肠道稳态。TGEV感染后48小时内猪小肠绒毛萎缩,继而出现隐窝增生,最终导致仔猪严重脱水直至死亡,是威胁全球养猪生产的最重要疾病之一。新生儿Fc受体是由α链和β链两个亚基以非共价键形式组成的异源二聚体,在免疫球蛋白Ig G转运和代谢中发挥重要作用。目前国内外有关病原感染人或者动物机体后对Fc Rn表达调控方面的研究报道较少。前期研究表明TGEV感染IPEC-J2细胞能够上调Fc Rn表达,而TGEV N蛋白作为病毒的结构蛋白,不仅能够诱导机体的细胞免疫,而且对病毒基因组RNA的复制和转录也有重要的作用。因此本研究利用N蛋白刺激IPEC-J2细胞,探讨其上调Fc Rn表达的机制并确定其关键功能域以及上调Fc Rn表达能否促进Ig G的跨膜转运。主要研究内容和结果如下:1.TGEV N蛋白的原核表达及兔抗TGEV N蛋白多克隆抗体的制备通过原核表达系统诱导表达TGEV N蛋白,将GST-N蛋白纯化后辅以佐剂免疫家兔,制备了兔抗TGEV N蛋白的高免血清,Western Blot检测结果表明该多克隆抗体具有良好的特异性。2.利用杆状病毒表达系统表达TGEV N蛋白利用杆状病毒表达系统表达的蛋白能够进行更加复杂的加工和修饰,使表达蛋白接近天然状态。构建含TGEV N基因的重组杆粒并转染至Sf9细胞,经Western blot和间接免疫荧光检测,证明了TGEV N蛋白成功在Sf9细胞中得到表达,其蛋白大小约为49KDa。3.TGEV N蛋白通过NF-κB信号通路上调Fc Rn的表达利用TGEV N蛋白刺激IPEC-J2细胞,通过q PCR和Western blot检测发现该蛋白能剂量依赖地上调Fc Rn的表达。p65的磷酸化和转核是NF-κB活化的标志,通过Western blot和激光共聚焦实验发现TGEV N蛋白能够促进p65的磷酸化和入核。用si RIG-I预处理的细胞能够降低TGEV N蛋白上调Fc Rn的表达量,该结果表明RIG-I参与了TGEV N蛋白诱导Fc Rn表达上调的途径。4.TGEV N蛋白调控Fc Rn表达的结构功能域为了探究N蛋白调控Fc Rn表达的结构功能域,通过构建不同的截短蛋白表达质粒并转染IPEC-J2细胞,利用q PCR和Western blot对Fc Rn表达量进行检测,最终确定N蛋白功能域位于128-252位氨基酸之间。5.TGEV N蛋白上调Fc Rn表达增强其介导的Ig G跨膜转运利用IPEC-J2细胞构建体外胞转模型,加入重组N蛋白预处理细胞。将生物素标记的猪Ig G(biotin-Ig G)加入胞转模型,经Western blot检测,结果发现Ig G的转运增强,以上实验证明TGEV N蛋白可以通过上调Fc Rn表达增强Ig G的跨膜转运。本课题通过真核表达系统对N蛋白进行了外源表达,并对N蛋白上调Fc Rn的机制进行了探究,利用胞转模型验证了N蛋白上调表达的生物学意义。