【摘 要】
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提高家畜产肉性能,培育高产优质的肉用家畜新品种是育种工作的目标之一,通过基因编辑技术可以快速改变特定基因组成,获得需要的优良性状。MSTN基因为骨骼肌生长的负调控因子,
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提高家畜产肉性能,培育高产优质的肉用家畜新品种是育种工作的目标之一,通过基因编辑技术可以快速改变特定基因组成,获得需要的优良性状。MSTN基因为骨骼肌生长的负调控因子,该基因的突变会导致动物肌肉发达、体重增加；fat-1基因编码ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶,可以将多不饱和脂肪酸从ω-6转化为ω-3形式,fat-1基因的增加有利于提高动物体内ω-3的含量。本研究利用最新的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了敲除山羊MSTN基因的同时在该位点插入fat-1基因的gRNA载体和fat-1基因定点敲入载体,利用电转法将载体转入绒山羊胎儿成纤维细胞中,筛选阳性单克隆细胞,通过体细胞克隆的方法生产转基因绒山羊,期望培育出在提高羊肉产量的同时增加羊肉中ω-3含量的家畜新品种。1、载体的构建本实验成功构建了2对基于MSTN基因一号外显子的gRNA表达载体,通过Survery酶切突变检测gRNA2突变效率高于gRNA1;同时成功构建了含有fat-1外源基因且可以定点整合至宿主基因组MSTN位点的敲入载体5’h-pCAGD NA3-fat-1-3’h。2、转基因单克隆细胞系的筛选本实验使用电转法将线性化的fat-1载体、gRNA2和Cas9载体按比例转入羊胎儿成纤维细胞中,通过流式细胞仪和口吸管2种方法挑取单克隆细胞。共成功获得156株单克隆细胞,经过PCR和测序鉴定,其中在MSTN基因位点定点整合fat-1基因的细胞系40株,外源基因整合效率为25.64%。3、转基因绒山羊的制备挑选1株阳性细胞通过体细胞核移植技术生产胚胎,共获得249枚胚胎,选择其中的134枚克隆胚移植到56只受体羊中,成功获得1只转基因绒山羊,其生长发育良好,经PCR初步鉴定在MSTN基因位点整合入fat-1外源基因。
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