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研究目的及意义：原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma, PHC)是我国最常见的消化系统恶性疾病,以其强烈的侵袭性和转移性、极短的存活率使之迅速窜升我国恶性肿瘤死亡率的第二位。由于肝癌发病的隐匿性,绝大部分患者在就诊时已处于临床晚期,无法进行手术根除治疗,且由于荷瘤机体内T辅助淋巴细胞(Helper T Cells, Th)分化失衡、树突状细胞(dendritic cells, DC)数量减少及功能缺陷,机体抗肿瘤免疫无能或低下、化疗效果及预后均差。文献报道,机体的免疫能力对恶性肿瘤的发生、发展起着重要的调控作用,免疫疗法已成为当今抗癌治疗的重中之重,如何提高荷瘤机体抗肿瘤免疫力成为目前肝癌治疗的核心问题,基于中药多糖在预防肝癌发生及减少复发,拮抗放、化疗的毒副作用,增强免疫力延长生存期等方面的优势,临床上联合中药多糖治疗肝癌的应用也越来越广泛。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides, LBP)是中药枸杞子发挥抗肿瘤作用的关键成分,大量药理实验研究表明LBP对荷瘤机体产生显著的免疫调节作用(如调节荷瘤机体多种免疫效应细胞：T细胞、细胞毒T细胞、巨噬细胞等细胞活性以及诱生多种抗癌细胞因子的功能),从而抑制肿瘤生长,但其作用于肿瘤的具体分子及免疫学机制尚未清楚。文献报道CXC趋化因子配体10(C chemokine ligand-10 XCL10)可以趋化T细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等多种炎症细胞至肿瘤发生部位杀死肿瘤细胞,并且CXCL10的表达与肝炎、肝硬化、肝癌等肝脏疾病关系尤为密切,枸杞多糖联合细胞因子CXCL10治疗肝癌是一次崭新的尝试,本实验组在前期课题组的研究基础上,首先通过体外实验,,明确LBP在细胞水平上对人肝癌HepG2细胞生长具有抑制作用,其次通过体内实验,在动物水平上探讨LBP单用或者联合CXCL10抗实验性肝癌作用及其具体的免疫学机制。方法：1体外实验：LBP对人肝癌细胞株HepG2的杀伤效果及联合氟尿嘧啶的增敏作用：1.1确定LBP对HepG2的抑制效果：将HepG2细胞混悬液以3500/孔种于96孔板,以200mg/L,400mg/L 800mg/L, 1000mg/L四个浓度加药作用于HepG2,另设不加药组对照。以MTT法检测药物作用癌细胞的相对抑制率。1.2 LBP联合氟尿嘧啶的增敏作用：选用LBP两个剂量(200mg/L,400mg/L)联合5FU(lumol/L),另设单药及不加药对照组,以MTT法检测各组药物作用癌细胞抑制率,以金氏Q值法评定两药协同或相加效果。2 体内实验：建立实验性肝癌小鼠(H22皮下瘤)模型,随机分为肿瘤模型组、LBP(50mg/kg)灌胃组、LBP+CXCL10(50 mg/kg灌胃+右胁皮下注射15ug/kg)组、CXCL10(右胁皮下注射15ug/kg)组、环磷酰胺(20mg/kg)或氟尿嘧啶(5FU) (12mg/kg)腹腔注射组,每组12只。每天给药一次,连续两周后眼球取血,分离小鼠肿瘤、脾脏、胸腺后称重,计算肿瘤抑制率、脾脏及胸腺指数。采用流式细胞术检测外周血Thl/TH2分化情况,ELISA技术检测各组小鼠外周血Y-干扰素(IFN-γ)),白介素-4(IL-4)蛋白表达情况。荧光定量PCR技术检测外周血白介素-12(IL-12)及肿瘤坏死因子a (TNF-α) mRNA表达,制作肿瘤组织病理切片,常规HE染色观察各组肿瘤组织内肿瘤细胞密度及淋巴细胞浸润情况,免疫组化方法检测S-100蛋白在肿瘤间质浸润DC的表达。结果：1 枸杞多糖对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用及联合氟尿嘧啶增效作用与空白对照组相比较,枸杞多糖在200mg/L,400mg/L 800mg/L, 1000mg/L的抑制率分别为9.23%,22.80%,36.84%,76.25%,枸杞多糖(200mg/L、400mg/L)联合5FU(1umol/L)后的Q值分别为1.12,1.62,为相加和协同作用。2枸杞多糖单用及联合CXCL10对H22肝癌小鼠的抑瘤及对免疫器官的影响枸杞多糖单用及联合CXCL10对肝癌小鼠的肿瘤生长均起到了明显的抑制作用,与模型组相比,各用药组肿瘤体质量均降低,尤其以LBP、LBP+CXCL10、阳性用药组(5FU组)效果显著,各用药组抑制率分别达到了55.90%,52.82%,65.58%,且具有统计学意义；LBP、LBP+CXCL10明显提高了脾指数,LBP、LBP+CXCL10、 CXCL10组胸腺指数均有上升趋势,但与模型组比较无统计差异。3枸杞多糖单用及联合CXCL10对H22肝癌小鼠外周血T辅助细胞分化结果枸杞多糖单用及联合CXCL10组对H22使荷瘤小鼠外周血Thl细胞增多(由模型组10.61±4.72分别提高至28.38±21.98、24.26±13.86)而Th2细胞减少(由模型组21.48±23.23分别减低至7.71±5.24、5.46±2.90)的明显趋势,Thl/Th2比率也有所提高,由模型组的0.87±0.42分别上升到6.05±7.83,6.12±3.89.4枸杞多糖单用及联合CXCL10对H22肝癌小鼠外周血y-INF, IL4蛋白表达的影响与肿瘤模型组相比,枸杞多糖单用及联合CXCL10能使H22肝癌小鼠外周血INF-γ分别提高至134.26±19.62、129.44±24.47ng/mL,使外周血IL4分别降低至62.77±8.79、58.10±8.54ng/mL, INF-γ/IL4比值分别提高至2.14±0.10、2.22±0.13,且P均<0.05.5枸杞多糖单用及联合CXCL10对H22肝癌小鼠外周血IL12、TNF-α mRNA表达与模型组相比,枸杞多糖单用及联合CXCL10使荷瘤小鼠外周血IL-12mRNA表达分别上调了2.94、3.39倍(P<0.05),而TNF-α分别上调1.55、4.74倍(P<0.05).6枸杞多糖单用及联合CXCL10对H22肝癌小鼠肿瘤浸润DC的S-100蛋白表达影响免疫组织化学方法检测S-100蛋白肿瘤浸润DC的表达情况发现,与模型组相比,枸杞多糖单用及联合CXCL10用药组S-100+DC数量明显增多,多表现为高度浸润,均具统计学差异(P<0.05)结论：体外实验通过MTT法检测枸杞多糖对人肝癌细胞株(HepG2)生长具抑制作用及联合阳性抗肿瘤药5FU具增敏效果,在明确了LBP具有体外抗瘤作用基础之上,设计体内实验通过H22肝癌腹水移植瘤小鼠肿瘤生长曲线,肿瘤质量抑制率、病理形态学观察,流式细胞术,ELISA,荧光定量PCR,免疫组织化学等技术,探讨了枸杞多糖单用及联合CXCL10对小鼠肿瘤生长的影响,并初步揭示了其作用的分子学及免疫学机制,我们得出以下结论：LBP具有抗肝癌腹水移植瘤作用,其作用与以下免疫学机制有关：1 LBP及LBP+CXCL10可以通过提升荷瘤小鼠的脾脏、胸腺等免疫器官指数,提高机体整体的免疫功能；2 LBP及LBP+CXCL10可以促进Th1型细胞因子分泌及恢复Thl/Th2平衡,提高DC细胞数量及其功能,干预荷瘤机体免疫抑制状态而提高机体抗瘤免疫功能。