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云南箭竹(Fargesiayunnanensis Hsueh et Yi)隶属禾本科竹亚科箭竹属,是箭竹属中秆型较大的一种,也是分布海拔较低的一种,主要分布于云南昆明、丽江、永仁、宾川、昌宁等地,生于海拔1700~2400m山区云南松林或阔叶林下,在分布区内亦普遍栽培,为本属中分布海拔最低、栽培最广者。在其自然分布中,云南箭竹有两个区别较大的品系:滇中至滇西分布的品系其分枝相对较低,秆箨新鲜时呈灰褐色,被面被块状密集贴生的棕色小刺毛,箨鞘通常长于节间,宿存,新鲜时淡黄色;而滇西北分布的品系其分枝相对较高,秆箨新鲜时呈紫褐色,被面光滑无毛或偶有疏生棕色小刺毛,具有宽窄不等的明显的紫色条纹。云南箭竹系云南特产的优质笋用竹,其秋后产笋和抗寒性强的独特优势更使其开发价值倍增。一般竹类均为春季或夏季发笋,云南箭竹秋季产笋的特性正好补充了淡季市场。且云南箭竹还是优质秆用竹种。因此,云南箭竹被认为是滇中及以北高海拔地区最有推广价值和发展前景的优良竹种。
本研究利用RAPD技术对采集到的70份云南箭竹样品进行了遗传多样性的分析,研究现有资源的基因丰富程度及基因多样性的分布规律,为今后云南箭竹的保护提供理论依据。通过研究,取得了以下进展:
1.利用改良的SDS方法从云南箭竹叶片中提取高质量的DNA。
2.从昆明、大理、丽江、昌宁等云南箭竹分布地区采集到70份样品,其中紫色条纹型云南箭竹35份,褐色斑点型云南箭竹35份,为云南箭竹两种变异类型种质资源的研究和保存打下基础。
3.优化了云南箭竹RAPD-PCR的循环条件,得出了适合云南箭竹RAPD分析的PCR循环程序,从而建立了云南箭竹RAPD反应最佳体系及程序。通过正交法对RAPD反应条件优化,6个试验因子的最适条件为:模板DNA1-5 ng/μl,随机引物0.8~1.0μmol/L,dNTPs浓度0.1~0.15mmol/L,Mg2+浓度2.0~2.5mmol/L,Taq酶用量0.5U~1U,10×PCR Buffer2μl,PCR反应总体积为20μl。最佳热循环参数为:94℃预变性2min,之后进行40个循环(94℃变性30sec,36℃退火60sec,72℃延伸90sec),最后72℃总延伸7min后在4℃终止反应。
4.用110个随机引物对1份样品进行引物初筛,再从初筛出的30个随机引物对3份具区域和变异代表性的样品进行复筛,成功筛出了21个适合于云南箭竹RAPD分析的随机引物,这些引物可以扩增出丰富并且清晰的条带。
5.利用NTSYS-PC软件计算了70个样品之间的遗传相似系数和遗传距离,并用UPGMA法对云南箭竹的RAPD扩增结果进行了聚类分析,结果明显聚为2类:Ⅰ类群为紫色条纹型,Ⅱ类群为褐色斑点型,这与云南箭竹的宏观外形特征的区分相吻合,证明云南箭竹表型上的差异与遗传因素紧密相关。且可初步认为,云南箭竹的这两个形态上稳定的变异类型应该作为种下的分类单位看待。因聚类结果呈现出较明显的地域性,特别是昆明地区的云南箭竹聚类,说明地理上较近的同种个体之间遗传距离相距较近,亲缘关系较近。
6.从聚类分析的结果来看,70个云南箭竹样品之间的遗传相似性系数在0.98~0.55之间,表明了云南箭竹在遗传进化的过程中,随着时空的变化,地理位置的变迁,气候的改变,其基因组DNA发生了变异,从而构成了丰富的云南箭竹资源基因库。从DNA分子水平上来说,遗传距离的变幅越大,说明其遗传分化大、遗传多样性高,证明遗传背景的复杂性。研究结果表明:云南箭竹的遗传相似系数一般在0.7以上,表明云南箭竹在遗传上具有较高的稳定性。
7.由于云南箭竹的遗传多样性丰富,不同变异类型群体间的遗传分化较高,所以,在云南箭竹就地保护时应该建立尽可能多的保护点,对其生境进行必要的保护,使它能在自然界中自然恢复。在进行云南箭竹迁地保护时,要广泛地对其群体和竹丛加以充分的采样,以保持其丰富的遗传多样性。