论文部分内容阅读
研究目的:观察卵巢生理性衰老过程中lncRNA表达谱的变化,筛选并鉴定与Hippo信号通路相关且具有卵巢特异性的lncRNA,探讨其在不同时期卵巢组织中的表达。为进一步丰富卵巢发育调控的分子网络增添新资料,为寻找有效的早期卵巢衰老生物标记物提供参考。研究方法:1.利用高通量测序技术检测青年组(3个月)、卵巢功能减退组(11个月)和卵巢功能衰竭组(17个月)小鼠卵巢组织中lncRNA的表达,观察卵巢不同功能状态下的lncRNA表达谱变化;2.利用生物信息学(GO与KEGG富集分析)分别对测序结果中差异性表达的lncRNA的靶基因进行功能注释,对相应的靶基因进行信号通路富集分析。并随机选择10条lncRNA,利用q-PCR验证测序结果的可靠性;3.分别在青年组(3个月)、卵巢功能减退组(11个月)和卵巢功能衰竭组(17个月)三组以及青年组(3个月)与卵巢功能衰竭组(17个月)两组表达差异的lncRNA中筛选与Hippo信号通路相关的卵巢特异性lncRNA,构建lncRNA-mRNA共表达网络;4.利用q-PCR及RT-PCR技术,分别检测筛选的Hippo信号通路相关卵巢特异性lncRNAs在心、肝、脾、肺、肾、胸腺、卵巢、肌肉、胃、脑10种组织中的相对表达水平,共得到3条Hippo信号通路相关卵巢特异性lncRNAs;5.利用q-PCR及RT-PCR技术,检测上述3条lncRNA在不同功能状态下卵巢组织中的差异性表达;6.进一步对上述3条lncRNA进行生物信息学分析,并利用RT-PCR技术对PCR产物Sanger测序,检测PCR产物是否与数据库报道的完整序列一致。研究结果:1.高通量测序结果显示:与青年组相比,卵巢功能减退组存在545个差异表达lncRNA(含361个上调、184个表达下调)。其中,已知lncRNA共300个(含156个上调,144个下调),新预测lncRNA有245个(含205个上调,40个下调);卵巢功能衰竭组存在664个差异表达lncRNA(含394个上调,270个下调),其中已知lncRNA共453个(含283个上调,170个下调),新预测lncRNA有211个(含111个上调,100个下调);卵巢功能衰竭组与卵巢功能减退组相比存在598个差异表达lncRNAs(含255个上调,43个下调),其中已知lncRNA共301个(含185个上调,116个下调),新预测lncRNA有297个(含70个上调,227个下调)。2.生物信息学分析结果(1)GO分析显示在卵巢功能减退过程中,lncRNA在蛋白定位、细胞与细胞之间连接、蛋白结合等功能条目显著富集;(2)KEGG通路分析显示,差异表达的lncRNA靶基因参与Hippo信号通路、MAPK信号传导途径、Wnt信号通路、Ras信号通路、B细胞受体信号通路、RNA降解、RNA运输等多种途径。3.对随机选择的lncRNA进行q-PCR验证,结果显示与测序结果表达趋势一致。4.q-PCR及RT-PCR结果表明与Hippo信号通路相关的卵巢特异性lncRNA有3条:ENSMUST00000210794、ENSMUST00000156781、ENSMUST00000144657。生物信息学分析显示,ENSMUST00000210794主要与Hippo通路的LATS2分子存在靶向关系,同时也参与Notch信号通路及MAPK信号通路;ENSMUST00000156781主要与Hippo通路的TEAD1及TEAD2分子存在靶向关系,同时也参与FoxO信号通路、TGF-beta信号通路、PI3K-Akt信号通路、AMPK信号通路、TNF信号通路及卵母细胞减数分裂通路;ENSMUST00000144657主要靶向Hippo通路的TEAD1分子存在靶向关系;同时也参与NF-kappa B和MAPK信号通路;5.q-PCR及RT-PCR结果表明,随着月龄的增加,ENSMUST00000210794与ENSMUST00000156781表达量逐渐降低,ENSMUST00000144657表达量逐渐升高。6.RT-PCR结果表明ENSMUST00000210794的扩增产物与数据库中序列比对一致。研究结论:1.卵巢生理性衰老过程中存在大量异常表达的lncRNA,这些lncRNA可能在卵巢衰老的发生、发展中发挥重要作用;2.有3条与Hippo信号通路有关的lncRNA具有卵巢组织特异性并与卵巢衰老具有明显相关性。