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血管内皮细胞(Endothelialcell,EC)的免疫功能日益受到重视,内皮细胞除了保证血管壁结构与功能完整,激活后还可表达或上调表达多种免疫功能相关分子,既可作为细胞因子、炎性因子作用的靶细胞,又能分泌细胞因子等活性介质,在机体的炎症反应和免疫应答过程中有重要作用。它具有多种免疫功能,与许多疾病的发生、发展有密切的关系。
EC以MHC-Ⅱ类分子限制性方式将抗原肽呈递给淋巴细胞,并可通过B7/CD28、CD40/CD40L、CD58(LFA-3)/CD2(LFA-2)等途径向淋巴细胞提供共刺激信号,促进免疫应答的进程。EC上表达的共刺激分子(LFA-3、CD40L、PDL-1、PDL-2、ICOSL、OX40L)和T细胞上表达的相应的受体结合后,一方面可以作用于EC而促使其活化和分泌细胞因子,另一方面又可以影响CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞活化和功能,从而参与特异性免疫应答的调控以及增强细胞因子的分泌。所以,共刺激分子在EC与T细胞的相互作用中发挥着重要的作用。
研究发现,共刺激分子在免疫应答的不同阶段介导免疫应答的启动、激发、扩大和增强作用以及效应介导,而且通过负性共刺激分子可精确地调节应答的程度和持续的时间。效应性CD8+和CD4+T细胞的维持和功能,以及记忆性T细胞发生再次应答不依赖B7-1/B7-2-CD28/CTLA-4和CD40-CD40L共刺激信号通路,针对调节记忆和效应性T细胞的功能达到维持外周耐受应选择ICOS-B7RP-1和PD-1-PD-L1/PD-L2信号通路,但是,有时ICOS-B7RP-1或PD-1-PD-L1/PD-L2信号通路不能完全抑制CD8+T细胞的功能,而CD137在调节CD8+T细胞的功能方面有着重要的作用。
我们初步研究证实,内皮细胞在未活化时有较低的CD137蛋白表达,内皮细胞活化后CD137的表达上调。CD137是肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的成员之一,它表达于活化的T细胞表面,介导的协同刺激信号能促进T细胞活化、增殖、分化,也能诱导T细胞凋亡。CD137既能协同CD28对T细胞的共刺激作用,也能不依赖于CD28而发挥共刺激效应。另外,CD137也表达于DC和单核细胞,并促进DC和单核细胞活化及分泌细胞因子。所以,我们设想CD137在内皮细胞上表达可能同样具有促其扩增及分泌的功能。
内皮细胞表面的CD137分子可能作为膜受体,当与相应的配体或抗体相互作用时,可介导细胞活化信号,促进其细胞因子的产生和分泌,参与炎症和免疫调节。由于CD137配体(CD137L)可以在活化的T细胞上表达,未活化或被LPS或其它介质活化后的内皮细胞,是否可以通过CD137/CD137L介导其与T细胞间的作用,从而对T细胞的特异性免疫应答发挥调节作用,这是我们需要进一步深入研究的问题。国内外均未见报导。为此,我们对CD137内皮细胞上的表达和功能以及在内皮细胞与T细胞相互作用中的意义进行了初步研究。本文研究的主要内容及结果包括:
1.成功的建立了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分离、培养的细胞模型,获得了传代稳定,具有足够纯度和数量的原代脐静脉内皮细胞模型,保证了后续实验的顺利实施。
2.采用RT-PCR、及流式细胞分析技术,较全面地研究了未刺激和不同细胞因子束激(TNF-α(25ng/ml)、LPS(100ng/ml)、IFN-γ(1000U/ml)、IL-1β(10ng/ml)、IL-1β+IFN-γ)活化人脐静脉内皮细胞上CD137分子的表达情况。并在24、48、48-72不同时间点检测了CD137分子的表达情况。从mRNA和蛋白水平证实HUVEC能组成性表达CD137分子,用IL-1β+IFN-γ协同刺激48-72h后,CD137分子表达明显升高,但是CD137L分子无论刺激与否都不表达。
3.应用激发型anti-CD137单克隆抗体交联内皮细胞上的CD137分子,CD137和抗体交联后向细胞内传递活化信号,成功地刺激了内皮细胞的活化,诱导内皮细胞合成和分泌细胞因子IL-1、IL-8及粘附分子ICAM-1。说明CD137向内皮细胞内传递活化信号,诱导内皮细胞活化。
4.应用PHA和IL-2协同刺激T细胞,诱导了T细胞活化,验证了CD137L在活化T细胞表面的表达,为下一步的功能研究提供了实验依据。采用共培养技术,模拟体内内皮细胞与T细胞的相互作用,首次应用活化的T细胞刺激了内皮细胞活化,诱导了内皮细胞合成和分泌细胞因子IL-1、IL-8以及粘附分子ICAM-1的表达。当应用可溶性融合蛋白CD137-Fc阻断后,内皮细胞合成和分泌细胞因子的能力降低。说明CD137-Fc成功地阻断了CD137/CD137L的相互作用,证明活化的T细胞通过表达的CD137L结合内皮细胞上表达的CD137,刺激了内皮细胞的活化。
5.采用细胞共培养,首次证明了活化的内皮细胞诱导表达CD137蛋白分子与活化的T细胞上诱导表达的CD137L相互作用,通过CD137L向T细胞内传递抑制信号,抑制了T细胞合成和分泌细胞因子的功能,T细胞分泌IL-2、IL-10和IFN-γ的水平下降。应用anti-CD137单克隆抗体阻断CD137/CD137L相互作用后,阻断了CD137L介导的抑制作用,IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌水平升高。同时,应用CCK-8试剂盒检测共培养后的T细胞的存活率并进行统计学分析,结果显示,T细胞的存活率下降,说明CD137L反向信号传导介导了凋亡信号,表明CD137/CD137L信号通路在内皮细胞与T细胞的信号作用中有着重要的地位。
综上,本研究在证实CD137分子在内皮细胞上的表达以及活化T细胞诱导表达CD137L的基础上,首次应用共培养技术探讨了CD137/CD137L刺激通路对内皮细胞以及对T细胞的刺激效应,同时也为研究内皮细胞与T细胞的相互作用提供了有益的补充和新的实验依据。而且为临床提供了新的治疗策略。