研究证明儿童口腔致龋菌的数量与龋病活性密切相关，因而定量研究儿童口腔的致龋菌对于儿童龋病的预防有重要的意义。目前，常规的细菌检测手段如细菌的分离培养、菌落形态观察、生化特性检验等，操作复杂、检测周期长，同时由于对致龋菌的选择性不强，因而特异性、灵敏性都有很大的局限。随着分子生物学技术的发展，PCR已经用于致龋菌的检测，给龋病研究带来了便利，但普通PCR无法满足定量检测的需要。本研究针对儿童口腔内主要的致龋菌—变形链球菌(s.mutans)和远缘链球菌(s.sobrinus)，采用目前先进的荧光标记、动态检测技术，建立了一种分子水平上的快速、准确检测两种致龋菌的实时荧光定量聚合酶链反应(FQPCR)方法，并在该方法基础上建立了儿童龋病的预测模型。其主要研究内容和结果如下： 实验1根据已发表的s.mutans 16S rRNA基因、s.sobrinus葡聚糖酶基因(dexA)的序列自行设计了PCR引物：P1：5’-GGT CAG GAA AGT CTG GAGTAA AAG GCT A-3’；P2：5’-GCG TTA GCT CCG GCA CTA AGCC-3’(771-750)；P3：5’-CAA GAC TGG AAC ACT TGG A-3’；P4：5’-GGT TGTAGT AGC GTT GGA-3’。采用PCR方法对12种变形链球菌群中包含a～h 8种血清型的标准菌及23种常见的口腔菌种进行PCR扩增、电泳鉴定、回收、测序。结果表明：自行设计的引物P1、P2、P3、P4的核苷酸序列与其它变形链球菌群标准菌和23种口腔常见菌之间无同源性；PCR产物测序结果与已发表的文献结果完全一致，具有很好的特异性；PCR最少能检测出10~2个细菌，优于DNA探针方法的10~5个细菌，有较好的敏感性，是理想的基因检测引物；通过比较3种模板制备方法，认为直接煮沸法完全可以满足PCR检测的要求，且较其它方法价格低廉、省时、省力，便于临床应用。 第四军医大学硕士学位论文 实验二在定性 PCR检测的基础上，分别设计两条 TqMan标记的寡昔酸 探针 Probel、ProbeZ（序列分别源于 s．mUtanS 16s iNA基因、s．sob… dexA 基因X 对己知数量的 s．mUtans、s．sobnnus标准菌和 3 5例儿童唾液样本核酸 模板进行PCR扩增，并与培养鉴定的方法进行对照检测。结果证明：不同浓 度的标准模板在反应过程中循环阈值（＊有极高的相关性（＞O．99）上不需P＊R 后处理，有效的避免了假阳性；通过与传统培养方法的对照检测，其检出率 优于传统方法，灵敏性为100％，特异性为94．62％，正确率达97刁3％，可满足临 床诊断需要。 实验 3在 FQ PCR方法准确可靠的前提下，对 203名 36岁儿童进行龋 病调查，同时采用 FQ pCR方法检测其口腔唾液 S．mtus、S．SObfllluS数量。6 个月后回访检查，根据调查结果建立儿童龋病LogistiC回归分析模型，对儿童 龋病危险性进行评估分析。结果表明：3巧岁儿童患龋率和 s．mUtans石．sobrinus 检出率都随年龄的增加而上升；龋病组和龋活跃组唾液S．ffilll8llS、S．SObdids 检出率。数量明显高于健康组和龋不活跃组；本实验选择相关性最好的3个 指标（唾液s．mUtanS、s．sobrinus计数对数值、龋失补牙面数）建立的儿童龋 病LOgistiC回归模型的特异性为92．78％，灵敏性为81．52％，总体正确率达 89．24％，显示了很好的预测效果。 综合以上实验结果，我们认为本研究所建立的实时荧光定量聚合酶链反 应方法可以快速灵敏的检测变形链球菌、远缘链球菌，此法优于传统的培养鉴 定方法，可以结合儿童唾液变形链球菌、远缘链球菌计数及当前龋失补牙面 数对乳牙龋病活性进行准确的预测、评估，为采取个体化的预防方法提供了 可靠的监控指标。