已知机体95％以上的感染发生在粘膜或由粘膜入侵，尤其是呼吸道和消化道粘膜，直接面对外界环境，时时刻刻接触大量繁杂的抗原，包括病原体。因此，粘膜是病原体感染和疫苗免疫最重要也是最常见的途径。和系统免疫相比，粘膜具有其独特的性质，随着人们对粘膜特性的认识的深入，粘膜疫苗和粘膜免疫成为感染免疫学和预防医学的研究热点和前沿，研究粘膜疫苗免疫反应规律和保护机制，是粘膜疫苗研制、改进及制定免疫实施方案的重要理论基础。通过应用粘膜疫苗载体和粘膜免疫可以解决基因疫苗和基因治疗中的一些尚难以解决的问题，近年来倍受基因疫苗和基因治疗研究者的青睐。因此，粘膜疫苗的免疫保护机制及作为外源DNA的携带载体的研究具有重要的理论意义和实际意义。本文就我室构建的两类不同侵袭表型的双价痢疾菌苗，研究不同动物模型、不同粘膜途径的免疫反应和保护机制，并就其作为基因治疗载体的可能性进行了初步研究。 FSM-2117和FS-5416(FS-5402，5411，5414)是我室构建的两类具有不同侵袭表型的福氏、宋内氏双价痢菌苗株，它们共同的特点是都稳定表达了福氏及宋内氏双价LPS-O抗原，不同之处是前者不表达侵袭蛋白抗原(Ipa-)，无溶血活性，无侵袭活性(inv-)；而后者则表达四种侵袭蛋白抗原(IpaA、B、C、D)，有溶血活性和侵袭活性(Ipa+＼inv+)。为了探讨两类双价痢疾菌苗(Ipa-、Ipa+)粘膜免疫后的免疫保护机制及其作为DNA治疗载体的可行性，本文首先在不同的动物模型，应用ELISA等方法观察了两类双价痢疾菌苗不同粘膜途径免疫动物后，局部和系统的双价特异性抗体的变化及不同粘膜免疫途径和侵袭蛋白表达对免疫反应和免疫保护的影响；而后应用电转染方法构建了双价痢疾菌苗和伤寒疫苗TRAIL DNA治疗载体，并初步观察了粘膜途径给药后外源基因体内表达情况及其抑瘤作用。主要研究结果： (1) 两类双价痢疾菌苗经灌胃、滴鼻、滴眼的粘膜途径免疫动物后，粘膜局部和(或)系统中福氏、宋内氏双价特异性slgA和IgG抗体水平较对照显著升高；抗体类别在粘膜部位以slgA为主，在血清中以IgG为主。说明两类双价痢疾菌苗具有较好的免疫原性。Ipa的表达可增加滴鼻免疫途径特异性抗体的水平和诱导较强的共同粘膜免疫反应。 (2)两类双价痢疾菌苗经灌胃、滴鼻、滴眼等粘膜途径免疫小鼠和豚鼠后，滴鼻免疫途径不仅可诱导较强的粘膜局部免疫反应和共同粘膜免疫反应，尤其是生殖道粘膜的抗体反应，同时也可诱导较强的系统免疫反应。而加大剂量的灌胃免疫除可诱导胃肠局部免疫反应外，还可诱导系统免疫反应。相比而论， 的粘膜免疫途径，不仅增强了疫苗的免疫效果，并大大降低了免疫剂可。m同一疫苗不间的免疫剂量、不同免疫途径诱导的局部姑）进双价抗体Ij现差并 和分离现象。说明选择合适的免疫途径和免疫方案对诱导有效的免疫反应十 分重要。W双价痢疾茵茵滴眼免疫可诱导有效的粘膜局部保护性抗体产生，有效地保护 动物，而且侵袭首的保护效果明显好于非侵袭苗。说明侵袭蛋白的表达是疫 苗免疫保护的必要的抗原。同时，免疫保护和特异性抗体升高水平之问并非 绝对平行一致，说明双价痢疾均苗除了保护性抗体机制外，还有其它免疫机 制存在。m两类双价痢疾菌苗菌均可诱导一定的免疫记忆反应，在胃肠道，非侵袭苗免 疫效果好于侵袭苗，而滴鼻途径则侵袭苗明显好于非侵袭苗。说明侵袭蛋白 的作用与免疫途径有关，胃肠道对多糖抗原敏感，而鼻粘膜、眼粘膜对蛋白 抗原更为敏感。（6）克隆了人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF related associated induced TRAIL人 构建了原核和真核表达载体，并分别进行了表达。在细胞模型上 观察到表达TRAIL分子的细胞株有一定的抗肿瘤活性。厂 构建了侵袭和非侵袭双价痢疾菌苗FSM三门和伤寒杆菌疫苗（TyZIa） pEGFPNITRAIL 治疗载体，牙 FSM－2117、FS－5416 及 TyZla pcDNA3．l－TRAIL治疗载体。FSM一二门 不 Ty21a pEGFP－NITRAIL治疗载 体经灌胃和滴鼻两种粘膜途径给药后，发现小鼠体内不同时问点、不同部位 上皮类细胞和淋巴细胞的绿色荧光蛋白的表达程度不同，在早期表现为免疫 部位表达，晚期在远隔部位例如肝脏和脾脏内细胞表达。＊ 应用 FSM－2117和 Ty21a pEGFPN 空质粒载体和 pEGFPNITRAIL治疗载 体滴鼻给药后可以有效抑制C57BJ小鼠B16肿瘤的生长，但空质粒载体和 ＊RA IL治疗载体之间没有统计学差异；同时可明显延长动物的存活期， 2117巾EGFP－NI－TMIL的作用最为明显，说明在这个模型上疫苗本身具有一 定的抑瘤作用，2117可能成为有效携带外源基因的活细菌疫苗载体。