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水牛精液冷冻保存主要用含卵黄的稀释液,但其冷冻保存效果不如黄牛,以致水牛种公牛的利用率远低于黄牛。因此,开发水牛精液冷冻保存稀释液配方,进一步提高精液冷冻保存效果,对于提高优秀种公牛利用率,加速水牛品种改良,具有非常重要的意义。此外,含动物源(卵黄、奶粉等)的精液冷冻保存液虽有较好的保护效果,但易传播疾病,在国际贸易中逐渐被淘汰。为了提高卵黄稀释液的冷冻保存效果,以及开发不含动物源物质的水牛冷冻精液新型稀释液,本研究以4头槟榔江水牛精液为试验对象,以现有卵黄稀释液作为对照,设计新的稀释液配方,通过评定冻后精子活率、畸形率以及运动性能：包括曲线运动速度(VCL)、直线运动速度(VSL)、路径运动速度(VAP)、直线型(LIN)、摆动性(WOB)和向前性(STR),探讨以卵黄稀释液为基础,添加不同浓度褪黑素或新抗生素(GTLS),以及用大豆卵磷脂替换卵黄,联合褪黑素和GTLS的冷冻保护效果,筛选出适合水牛的精液冷冻稀释液配方。GTLS由庆大霉素(Gentamicin,即G)、泰乐菌素(Tylosin,即T)、林肯霉素(Lincomycin,即L)和壮观霉素(Spectinomycin,即S)组成。结果如下：一、改进卵黄稀释液配方1、卵黄稀释液中添加褪黑素的精液冷冻保存效果：在卵黄稀释液中分别添加低(10-5mol/L)、中(10-4mol/L)、高(10-3mol/L)浓度的褪黑素后,发现添加低浓度褪黑素时,冻后精子的运动性能(VCL、VSL、VAP、LIN、WOB和STR)、活率以及畸形率有所改善,但褪黑素浓度过高时,精液的冷冻效果反而降低。低浓度组的VCL(14.26μrn/s)和VSL(5.09μm/s)比对照组分别提高了13.44%(P<0.05)和16.48%(P<0.05)。高浓度组的VSL(3.73μm/s)和活率(26.20%)比对照组的VSL(4.37μm/s)和活率分别下降14.65%(P<0.05)和22.53%(P<0.05)。中浓度组的冻后活率(36.55%)比对照组(33.82%)有所提高(P>0.05),冻后畸形率(36.96%)比对照(43.17%)有所下降(P>0.05)。因此,中浓度组试验效果最好,2、卵黄稀释液中用新抗生素组合(GTLS)替换青-链霉素(SP)的精液冷冻保存效果：抗生素G、T、L、S浓度分别是500μg/mL、100μg/mL、300μg/mL、600μg/mL,并以此(×1)为基准,配制高(×10)、中(×1)、低(×0.1)三种浓度组合,分别替换原稀释液中的SP。发现精液冻后质量随着抗生素浓度的增加而提高,但过高浓度的抗生素则会影响到冷冻效果。中浓度的VSL(5.35μm/s)、LIN (39.84%)、WOB (59.62%)和STR(66.43%)比对照组的VSL(4.57μm/s).LIN(34.47%)、WOB(54.32%)和STR(62.97%)均有所提高(P<0.05)。中(40.58%)、低浓度组(42.61%)冻后活率比对照(37.99%)有所提高,高浓度组(33.02%)则有所下降,但没有统计差异(P>0.05)。高浓度组的冻后畸形率有所下降,随着浓度的降低而增加。故卵黄稀释液中添加中浓度的抗生素组合冷冻效果最好。二、无动物源性稀释液配方研究1、用大豆卵磷脂替换卵黄的精液冷冻保存效果：用3%、4%和5%的大豆卵磷脂替换卵黄稀释液中的卵黄。结果发现3%大豆卵磷脂的VCL(15.88μm/s)、VSL(6.06μm/s)和VAP(9.19μm/s)显著高于对照组(12.82μm/s、4.57μm/s和7.72μm/s)(P<0.05)。但是,5%大豆卵磷脂对精子冻后活率(29.05%)有不利的影响,相比对照(36.45%)显著降低(P<0.05)。3%、4%和5%试验组冻后畸形率(42.58%、47.61%和45.30%)与对照(42.25%)相比,差异均不显著(P>0.05)。冻后活率随着大豆卵磷脂浓度的增加而降低(分别为38.55%、35.47%、29.05%),但与对照(36.45%)相比,差异不显著(P>0.05)。综上所述,大豆卵磷脂在某种程度上能够替换稀释液中的卵黄成分,以浓度3%的冷冻效果最好。2、大豆卵磷脂和新抗生素组合GTLS的联合应用效果：将浓度分别为3%、4%、5%的大豆卵磷脂和浓度分别为低(×0.1)、中(×1)、高(×10)的GTLS两两联合,发现随着大豆卵磷脂和抗生素浓度的增加,冻后精子的运动性能和活率呈下降趋势,畸形率呈北升趋势。其中,3%、40%和5%大豆卵磷脂结合高浓度GTLS的三个试验组的冻后活率(25.07%、24.07%、22.82%)均显著低于对照(34.45%)(P<0.05)。3%大豆卵磷脂与中浓度GTLS的联合应用中,VCL(14.58μm/s)比对照(12.82μm/s)有所提高了13.73%(P<0.05),冻后活率(36.37%)略高于对照(34.45%)(P>0.05),畸形率(41.37%)略低于对照(42.25%)(P>0.05)。3、大豆卵磷脂和褪黑素的联合应用效果：将浓度分别为3%、4%、5%的大豆卵磷脂和浓度分别为低(10-5mol/L)中(10-4mol/L)、高(10-3mol/L)浓度的褪黑素联合应用,发现：大豆卵磷脂和褪黑素的浓度与冻后精子的运动性能和活率成反比,与畸形率成正比。3%大豆卵磷脂与高浓度褪黑素组合中,VSL(4.01μm/s)、VAP(6.25μm/s)和冻后活率(30.77%)均低于对照组(4.89μm/s.7.50μm/s.36.88%)(P<0.05)。说明大豆卵磷脂与褪黑素联合应用的冷冻保护效果不佳。