大量直接对环境样品的分子生态学研究表明,自然界中的绝大多数微生物尚未被人们在实验室中分离培养出来,它们被称为未培养微生物或微生物暗物质。一方面,我们通过文献调研和前期实验,提出微氧(1%氧气浓度以下)是可能是影响许多微生物不可培养的一个重要因素。另一方面,我们拟通过培养平板“刮菌”的方法收集所有可培养微生物并结合16S rRNA基因高通量测序技术有效检测这些微生物类群,以此评估不同平板分离条件的微生物可培养率。本文以活性污泥样品为对象分离微生物,在三种氧气浓度培养条件(好氧,氧浓度约为0.05%的微氧条件以及厌氧条件)下,对微生物的分离培养影响以及评估平板上生长的微生物可培养率进行了研究。主要研究结果表明:(1)通过添加内参,改进的数据处理以及排除测序过程中样品间串样污染等方式,证明了本论文的研究在方法学上是可行的,所获得的实验结果是可靠的。(2)在活性污泥样品中,一共检测到904个zOTUs,这904个zOTUs在我们所有的培养平板上共检测到了 464个,在好氧,微氧,厌氧检测到的zOTU数量分别为327,409,361。从zOTU数量的角度,我们对所试活性污泥样品与培养条件下,微生物的可培养率评估为高达51.3%,证明了培养平板上存在大量可培养微生物,在常规分离操作时可能因其丰度小或不易被挑取被忽略。我们认为基于zOTU数量估计微生物可培养率的方法更能体现微生物能否被分离培养的真实情况。过去一直认为的从细胞数量角度估计微生物可培养率不足1%,99%以上的微生物不可培养很可能是对微生物不可培养问题严峻性的一种过度估计。(3)在所有的48个培养平板“刮菌”样品中,共划分了 1959个zOTUs,其中809个zOTUs鉴定为不同分类阶元水平的新类群,其中,这809个zOTUs在好氧,微氧,厌氧检测到的数量分别为434,601,487,微氧条件下获得的新种最多)。此外,实验分离平板上未检出任何门级别的微生物暗物质,在纲目科属种水平分别鉴定出1,6,5,45,90个新分类单元。(4)对原始活性污泥样品和平板样品进行主坐标分析(Principal Coordinate Analysis,Pcoa),发现在微氧或厌氧条件培养出来的微生物类群更接近原始活性污泥真实环境生活下的微生物类群,同时以原位水培养基作为培养基所培养出的微生物类群与原始样品相近,表明微氧或厌氧以及原位营养条件更为适合分离某些特定微生物,而活性污泥样品的菌群可能更加趋向于微氧和厌氧代谢。(5)平板法分离实验中,分离获得了 12株与模式菌株的16SrRNA基因相似度低于95%的纯菌,在微氧条件下,获得了潜在的新科,新属,新种级别微生物的属分别是1株,3株,1株。我们的研究从物种(zOTU)的角度对微生物的可培养率进行估计是一种更加合理的评估微生物可培养性的方法,并提示了应重新审视微生物不可培养问题的严峻性。相对于好氧和厌氧条件,在微氧条件下可以培养出许多新的微生物类群,暗示相当数量的环境微生物存在对氧气具有特殊适应性。虽然本研究依然没有培养出严格意义上的微生物暗物质门,但在纲及纲水平以下的微生物暗物质有所收获,鉴定出许多的前人未培养出的微生物种类。因此,利用微氧条件对细菌的分离培养以及使用高通量测序技术鉴定样品中的可培养细菌有望应用于其他自然和人工环境样品,为培养出更多的微生物暗物质提供了一种思路和信心。