论文部分内容阅读
植物油脂是一类重要的可再生能源,合理利用植物油脂可以在很大程度上降低对煤、石油等不可再生能源的过度开采。并且油脂在植物生长发育及抗逆过程中均发挥着重要的作用。拟南芥是研究油料作物的模式生物,因此,对拟南芥油脂代谢过程中相关功能基因的研究能够为其他植物的同类研究提供重要的科学资料。本文对类马铃薯贮藏蛋白磷脂酶A(Patatin-Related Phospholipase A)pPLAⅡα在拟南芥中的组织和时空表达以及参与种子油脂及粘液层代谢的功能进行了分析,得出如下结论：1.pPLAⅡα基因在拟南芥组织中的表达分析将pPLAⅡα的启动子构建到GUS融合表达载体上,通过浸花法遗传转化拟南芥,对筛选出来的转基因拟南芥阳性苗进行GUS活性分析,结果发现,pPlAⅡα启动子在拟南芥叶片中的表达活性最高,在油脂的重要储存部位胚中也检测到GUS信号,故推测pPLAⅡα可能参与拟南芥油脂合成。2.pPLAⅡα提高拟南芥种子油脂含量构建pPLAⅡα过量表达载体,转化拟南芥,获得pPLAⅡα-OE转基因植株,同时,筛选获得pPLAⅡα-KO突变体纯合植株。通过气相色谱法对pPLAⅡα转基因拟南芥种子的油脂含量进行测定,结果发现其油脂含量出现显著变化,与野生型相比,pPLAⅡα-OE转基因拟南芥种子油脂含量增加,而pPLAⅡα-KO突变体中种子油脂含量降低,由此可见,pPLAⅡα在种子油脂合成过程中起到促进作用。3.pPLAⅡα参与拟南芥种子粘液层合成利用钉红染色技术对pPLAⅡα转基因拟南芥种子粘液层进行观察并统计分析,结果表明,与野生型相比,pPLAⅡα-OE转基因拟南芥粘液层变薄,pPLAⅡα-KO突变体拟南芥粘液层变厚,这表明pPLAⅡα参与拟南芥种子粘液层合成。提取拟南芥开花后4、7和10天(4、7、10DPA)的角果RNA,通过RT-PCR分析发现,pPLAⅡα在这三个拟南芥种子粘液层合成的重要时期均有表达,其中在10DPA角果中表达量最高,而此时期是种子粘液层淀粉粒降解、柱状结构形成的关键时期。4.GL2直接调控pPLAⅡα在拟南芥种子中的表达有研究表明,GL2转录因子控制拟南芥种子粘液层合成,且gl2突变体种子油脂含量增加。我们采取gl2-2突变体4、7及10DPA的拟南芥角果,提取RNA,定量RT-PCR分析发现,pPLAⅡα在gl2-2突变体中的表达量较野生型均出现极显著下降,这说明pPLAⅡα位于GL2下游,可能直接受到GL2调控。通过酵母单杂交实验,我们进一步验证了GL2能够结合到pPLAⅡα启动子上。随后,通过逐步将启动子截短的方法,利用酵母单杂交技术将pPLAⅡα启动子的结合序列精确至365bp。进一步将启动子中的类L1-box结合元件(将其命名为L1-1 box和L1-2 box)制成探针,通过EMSA实验证明GL2HD-ZIP结构域能够与pPLAⅡα启动子中的类L1-box结合元件特异性结合。上述结果证明GL2直接结合到pPLAⅡα启动子序列的类L1-box顺式元件上,调控该基因的表达,影响拟南芥种子粘液层合成及油脂代谢。此外,以pPLAⅡα启动子构建pAbAi载体,并进行拟南芥转录因子酵母单杂交文库筛选,筛选到一个C2H2类转录因子At5g60470,又因前述实验已经证实GL2可以与pPLAⅡα启动子结合。因此,利用酵母双杂交实验,分析GL2与At5g60470之间是否存在相互作用,形成转录复合体调控pPLAⅡα的表达。但从结果来看,两者不存在直接相互作用,可能位于不同的调节通路中。5.GL2START domain与PA结合利用Fat Western blot实验验证GL2START domain是否与磷脂酸(PA)存在相互作用,实验结果表明,随着PA浓度增大,其结合信号逐渐增强,故GL2START domain与PA存在特异性结合。