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维生素B6（Vitamin B6，B6）是维生素B族成员之一，是维持机体正常生长发育必不可少的一种水溶性维生素。它包括三种结构十分近似的化合物：吡哆醇（Pyidoxine，PN）、吡哆醛（Pyridoxal，PL）和吡哆胺（Pyridoxamine，PM），分别以磷酸化的形式发挥作用，其中吡哆醛-5’-磷酸（Pyridoxal-5’-phosphate,PLP）为B6在体内的活性形式，通过与磷酸吡哆胺（Pyidoxamine-5’-phosphate，PMP）的互变，作为多种酶（氨基转移酶、氨基酸脱羧酶、半胱氨酸脱硫酶、胱硫醚酶等）的辅酶而发挥传递基团的作用。近年来人们发现B6除具有上述作用外，尚具有抑制肿瘤生长的作用，机体如果缺乏B6除可造成细胞免疫力下降外，还能通过激活转录作用促进肿瘤增殖；故当补充B6时则可改善机体的细胞免疫功能，对抗肿瘤的发生和发展。大剂量的B6还有抑制体外培养的肿瘤细胞生长，如肝癌细胞的生长以及调节某些基因表达的作用，表明B6和肿瘤细胞的生长代谢密切相关。目前认为它不仅是细胞赖以存活的必要物质，而且还是有效的生物调节因子。为探讨B6抑制肿瘤细胞生长的可能机制，本文在前期整体动物实验的基础上，又从细胞和分子水平方面，利用H22小鼠肝癌细胞和SMMC-7721人肝癌细胞系观察B6对离体状态下细胞增殖的抑制情况，并探讨初步机制，旨在为进一步开发应用B6防治肿瘤提供新的实验依据。 中文摘要主要实验内容如下：1．14种临床常用化疗药物及 PN对 HZ。小鼠肝癌和SMMC刁72人肝癌两个细胞系的增殖抑制作用：肿瘤细胞生长于含 15％灭活小牛血清的 DMEM培养基中，以 2 X10‘·0．2＊l＊·IL1接种于 96孔细胞培养板，再加入终浓度分别为 2、3、4和 6mmol·L”’的 PN及不同浓度的 14种化疗药物，置 37”C 5％CO。培养箱中培养 24、48和 72h后，MTT法比色，用 5 70urn滤光片读取 OD值。结果在培养48h后，14种化疗药物中 6种可抑制 H。。小鼠肝癌细胞生长，11种对 SMMC刁72人肝癌细胞敏感，其中对两种细胞均敏感的药物有表阿霉素kADMX阿糖胞昔（Ara七X异环磷酚胺OCTX）三种。浓度分别为 2A和 6mmol·L”‘的PN，培养48h后，对H。。小鼠肝癌细胞的抑制率分别为26．5％。45．1％和55．6％；对94M94MC刁 人肝癌细胞的抑制率分别为 29．7O、31．lO和 55．3％。上述结果表明，即使是柏同组织学类型的肿瘤细胞，由于来源于不同种属，它们对同一种抗肿瘤药物的反应亦不完全相同，但PN对上述两种肝癌细胞系增殖抑制作用的效果却十分相似，提示PN可能具有潜在的广谱抗肿瘤作用。2．PN对小鼠H℃肝癌细胞系增殖抑制作用的剂量效应和时间效应：分别将 2、3、4和 6mmol·L－’的 PN与 Hu小鼠肝癌细胞培养 24、48和 72h后，结果从3mrnol·L”’开始PN即对细胞有明显的细胞毒作用，IC50二smmol工－‘，回归分析表明，培养48h各组药物剂量与细胞毒作用之间存在明显的正相关什二0．9764人表明PN对Hn小鼠肝癌细胞的增殖抑制作用存在着明显的剂量效应和时间效应关系。 2 中文摘要 3、H。。小鼠肝癌细胞内 GST活性和 MDA含量及转氨酶活 性的变化：分别收集经 smmol工”‘的 PN处理 24h及未经 PN处理的H22小鼠肝癌细胞，离心弃上清，沉淀用含 20mmol·L“’琉基乙醇（ME）pH7．4的 PB液洗涤离心，取 lml上述 PB液悬起，冻融 2次后超声粉碎，4℃10，000r／min 离心30min，取上清用于谷眈甘肽硫转移酶（GST）话性和 丙二醛（MDA）含量及转氨酶活性检测＊叫 人结果 24h PN处理组 GST活性为 3 5．6土 16．7mU·mg－‘蛋白，比对 照组的 13．8士9．4mU、g－’蛋自升高了约 1580(P＜0．002人 蛋白质含量测定采用考马氏亮蓝法（Brandford法人 用牛 血清白蛋白作标准；PN处理组MDA含量为0．13 3士0．06 mof·ml－’，卜对照组0．308士0．22mof·ml1降低 了56．8O 左右o＜0刀5），两指标处理组与非处理组相比均有显著差 异。上述结果表明，PN处理可引起细胞内抗氧化酶活性升 高，同时可减少脂质过氧化产物的生成，有保护细胞免受 自由基损伤的作用。而24h处理组的丙氨酸氨基转移酶 （ALT）及大冬氨酸氨基转移酶（AST）活性均明显低于 对照组，其中 AST的活性仅为对照组的 0．6O(P＜0．000入 ALT的活性亦下降到对照组的 50％左右(P＜0．of人 此二 酶活性的降低可能与PN导致相应的蛋白表达受抑制有关。 4、抗PPXy一蛋白偶联物单克隆抗体的制备及应用： 4＊采用高碘酸钠(NaIO＊氧化法制成PPxy平p清蛋自偶 联物用作免疫原，PPXy－牛血清白蛋白偶联物用于克隆筛 选，前者免疫BALB儿 ’J＼鼠，先制备出分泌抗PPXy平清