肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,由于肝癌起病隐匿,缺少早期诊断标志物使大部分病人在确诊后失去手术机会,化疗仍是肝癌治疗的重要手段。蒽环类药物是目前已发现的最有效的抗癌药物之一,但是该药物在使用过程中产生的耐药及严重的心脏毒性,极大地限制了它们在临床上的应用。羰基还原是目前被公认的形成蒽环类药物耐药和心脏毒性的机制之一,众多研究发现人羰基还原酶I(Carbonyl Reductase 1,CBR1)通过代谢柔红霉素和阿霉素的C-13羰基形成相应的醇产物,会减弱药物的抗癌作用,并导致心脏毒性。开发针对CBR1的抑制剂,与蒽环类药物联用应用,一度成为研究的热点。前期我们筛选到了一个新的CBR1抑制剂：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),在肝癌细胞中联合应用EGCG和柔红霉素,我们发现EGCG能显著增强柔红霉素的抗肿瘤作用,并且具有CBR1蛋白依赖性。在动物水平上,我们观察到了类似的增效作用。此外,EGCG还显著减轻了柔红霉素引起的心脏毒性,为蒽环类药物更好地应用于临床提供了有益的线索。但是CBR1除了能代谢柔红霉素及文献报道的阿霉素,还能否代谢其他的蒽环类药物；羰基还原酶家族其他的成员对蒽环类药物是否也存在代谢作用；EGCG除了能抑制CBR1作为增效蒽环类药物的靶点,是否也会作用于羰基还原酶家族的其他成员；都不是很清楚,本课题将基于这些问题进行研究。我们表达纯化了具有羰基还原活性的CBR1蛋白,检测其对四种临床常用蒽环类药物的代谢能力,包括柔红霉素(DNR),阿霉素(DOX),表阿霉素(EPI)和去甲氧柔红霉素(IDA),发现CBR1除了能代谢柔红霉素,还对去甲氧柔红霉素表现出较强的代谢活性,但对阿霉素和表阿霉素的代谢活性相对较低。我们选用了IDA进行后续的研究。在CBR1表达量相对较高的HepG2和SMMC-7721肝癌细胞株中,我们发现EGCG也会增效IDA抑制肿瘤细胞增殖的作用,而在CBR1表达量较低的Hep3B细胞中,这种增效作用消失,提示EGCG对IDA的增效也依赖于CBR1表达。为做进一步验证,我们通过在Hep3B细胞中过表达CBR1基因,在HepG2细胞中干扰下调CBR1的表达,分别进行药物联用实验,证实EGCG对IDA抗肿瘤作用的增效的确是具有CBR1依赖性的。在人羰基还原酶家族的四成员中,CBR2在肝脏中超高丰度表达,提示其在肝脏的代谢和解毒过程中可能发挥重要的作用,因此我们选取CBR2为代表,探索它在蒽环类药物代谢中的作用。我们通过表达纯化得到有活性的CBR2蛋白,经体外酶活实验,发现CBR2对IDA显示了最强的代谢作用,对其它三个药物的代谢相对较弱,与CBR1的相同点是,两者都对IDA有较强代谢作用。乙二醛酶I(Glyoxalasel, Glol)主要存在于细胞质中,在体内与乙二醛酶Ⅱ(G1o2)以及一定催化剂量的谷胱甘肽(GSH)共同构成了乙二醛酶系统,主要参与丙酮醛(MG)的代谢解毒。MG是糖酵解的副产物,属反应活性非常高的小分子醛类,具有细胞毒性,健康人体内会通过细胞内乙二醛酶系统维持MG水平的平衡。Glol已被报道在很多恶性肿瘤中高表达,并与肿瘤多药耐药的形成有关,但关于Glol在肝癌中的功能研究还鲜有报道,因此本研究将对Glo1在肝癌中的功能作一个初步的探索。我们通过RT-PCR技术,在mRNA水平检测了Glo1在73对肝癌的癌和癌旁样本中的相对表达量,发现有43对肝癌样本中出现了Glo1的显著上调表达,占总样本的58.9%,只有5例样本中出现了表达下调,Glo1的差异性表达提示我们其可能在肝癌的发生发展中起重要作用。关于Glol在肝癌中上调表达机制,我们也做了初步探索。糖酵解途径异常活跃是肿瘤组织的特征之一,由于我们目前不能直接检测肝癌组织糖酵解的强度,于是检测了糖酵解过程中的一个重要酶：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在肝癌组织中的表达,发现GAPDH的表达呈上调趋势,并且和Glo1的表达显著正相关；当我们用一定浓度的MG刺激肝癌细胞株,发现G1o1的表达上调,由此推测Glo1的上调可能是为了清除肿瘤组织中旺盛糖酵解产生的副产物MG的累积,以保证肿瘤细胞的正常生长；由于氧自由基的产生也是肿瘤微环境的特点之一,我们用H202模拟氧化应激,刺激肝癌细胞,也会引起Glo1的升高。为了研究Glo1的表达对肿瘤细胞生长的影响,我们对几种肝癌细胞株中的Glo1表达进行了RNA干扰实验,发现消减G1o1的表达后,细胞的增殖明显受到抑制,在Hep3B,SK-HEP-1,SMMC-7721细胞中观察到了一致的结果,提示我们Glol的正常表达对细胞的生长非常重要,不过我们在这些细胞中过表达Glo l,并未观察到其对细胞生长的促进作用。下调Glol基因的表达为什么会抑制细胞的生长?我们推测,有可能是干扰Glo1后引起了它的具有细胞毒性的底物,即MG在细胞内的累积所致。为验证这一假说,我们建立了HPLC-UV方法来检测细胞内的MG水平,发现当细胞内的Glo1表达被下调后,细胞内的MG水平升高,并在]Hep3B,SK-HEP-1, SMMC-7721细胞中观察到了一致的结果。关于验证MG的细胞毒性,我们向细胞培养基中加入MG刺激,生长曲线结果显示在高MG的环境中,细胞生长确实受到抑制。为了检测Glol的差异表达是否也会影响肝癌细胞株对抗癌药物的敏感性,我们在Glol表达量相对较低的Hep3B细胞中过表达Glo1基因,对常用的9种抗癌药物进行筛选,发现细胞对大部分抗癌药物的敏感性下降；反之,当我们将SK细胞中表达量相对较高的Glo1进行抑制后,发现细胞对大部分抗癌药物的敏感性升高,表明Glo1的表达量影响了肝癌细胞对药物的耐受。最后我们对Glo1编码区的一个SNP位点(rs2736654)进行了测序分析,该位点的碱基变换为A和C,对应的氨基酸为Glu和Ala,此位点可能会对Glo1的酶活产生影响。通过对205例健康人和332对肝癌病人的测序比对分析,我们发现C型在肝癌病人中的频率更高,具有显著性。综上所述,我们的研究结果表明Glo1作为MG解毒酶主要参与者,在肝癌组织中高表达。干扰Glo1的表达会引起细胞内MG水平升高,从而影响肝癌细胞株的生长。此外,Glo1的表达水平还会影响肝癌细胞对抗癌药物的敏感性。本研究对Glo1在肝癌发生进程中的功能进行了初步探讨,提示Glo1可以作为肝癌治疗的潜在靶点。实验过程中,我们发现EGCG也能抑制CBR2的酶活性,那么CBR2是否也参与了EGCG对IDA的增效作用呢?我们检测了几种常见肝癌细胞株中的CBR2蛋白表达水平,在CBR2表达水平较高的HepG2细胞中,下调了CBR2的表达,结果显示细胞对IDA的敏感性也出现了升高,同时EGCG对IDA的增效作用出现了被减弱的趋势；而在CBR1和CBR2基因双消减的HepG2细胞中,EGCG的增效作用完全消失；另外,我们在Hep3B细胞中进行了CBR2基因的过表达,发现细胞对IDA的敏感性降低,同时EGCG对IDA也出现了增效作用,以上结果说明,CBR2也在EGCG对IDA的增效过程中发挥了作用。最后我们检测了68对肝癌和癌旁样本中CBR1和CBR2 mRNA的相对表达量,与已有的报道类似,两者在肝癌中的表达均呈下调趋势,并且CBR1和CBR2的表达水平显著相关(R=0.6117,P<10-7),这是否意味着EGCG和蒽环类药物联合应用的意义不那么重要呢?事实并非如此,已有研究发现蒽环类药物刺激时,肿瘤细胞内CBR1的活性会升高,我们在肝癌细胞株Hep3B和HepG2中也发现蒽环类药物会同时上调CBR1和CBR2的表达,表明羰基还原酶的抑制剂EGCG和这些药物搭配使用还是非常有必要的。综上所述,我们的研究显示EGCG能增强IDA的抗肿瘤活性,这是一种新的药物配伍策略,而且表明EGCG发挥这一作用具有CBR1和CBR2蛋白的依赖性,本研究为此类药物联用策略提供了更进一步的机制阐述和理论支持。