论文部分内容阅读
EGF为生长因子家族中的主要成员，主要由颌下腺腺管细胞分泌。研究表明EGF有促进体表创伤愈合的确切疗效，因此从一开始EGF主要被用于烧伤，体表溃疡等大面积创口的治疗，已有外用凝胶剂收入药典。以后的研究发现外源性的EGF能促进角膜上皮细胞的增生，相应的EGF滴眼液亦被开发出来。进一步深入研究发现EGF在体内消化道有最高的浓度，可能用其治疗胃肠道疾病。但EGF在基础研究方面仍存在着许多另人不解的问题如EGF／EGFR作用的信号传递过程。在临床作用的研究上也存在大量有待进行的工作如对萎缩性胃炎的促增殖作用研究有望用于治疗萎缩性胃炎。对肠黏膜的促增殖作用有望用于治疗炎症性肠病如溃疡性结肠炎等。开展对EGF的研究有着重大意义和巨大的经济价值。另一方面EGF的药用开发目前普遍存在着投资大、消费高和收率低等缺陷，使其不能完全产业化。生产EGF现有三种方法：化学合成法，其合成的产物的纯度及产率度都无法满足工业化生产要求；基因工程法，投资大，其制成的EGF价格昂贵；生物提取法，主要从小鼠颌下腺提取，但小鼠颌下腺产率低，来源有限。因此探索新的药源对开发生产EGF有着巨大的经济价值。本研究结合EGF基础和临床研究探索从羊颌下腺制备、纯化EGF，在溃疡性结肠炎及萎缩性胃炎大鼠动物模型上应用羊颌下腺分离的EGF进行治疗，同时研究EGF作用机制及探讨EGF调控基因表达的信号传导途径。 浙江大学博士学位论文 第一部分山羊领下腺EGF的分离、纯化及鉴定 表皮生长因子(Ep 1 dermal Growth Factor EGF)是由53个氨基酸组成的小分子多肤类生长因子，是一种强有力的细胞分裂促进因子。近年来国内外开展了许多表皮生长因子临床药用和保健作用的研究。目前EGF的药用研究己进入了二次研发阶段，主要集中研究其消化道效应。尽管EGF的临床用途广泛，但由于其价格昂贵而限制了其在临床的应用，而导致 EGF价格昂贵的主要原因就是现有EGF提取的工艺复杂，产量少，成本高，现有EGF的提取工艺主要有两种(l)由小鼠领下腺提取(国内):产率0.06毫克/只，提取1克需要小鼠16667只，不但成本高，且可能造成潜在的环境污染。(2)基因工程制备(国外):工艺流程复杂，投资巨大，所需环境指标苛刻，目前国内开展困难。 因此研究开发廉价、效高的药用EGF以适应临床需要有重要意义。1.目的从山羊领下腺分离、纯化具有生物学活性的EGF。2.方法2.1 EGF的粗分离称取家畜领下腺(新鲜或冻干粉)按比例加入HAC(4C)匀浆，离心两次后合并两次上清液，用3mol/L的NH10H调PH至6.5，加NaCL至0.4二，)1/L静置过夜，离心15000转/分钟，20分钟。用ZOInln。1/LtriS.HCL PH5.56缓冲液悬浮。供色谱分析。2.2分子筛色谱称取20克SephadexG15干粉，用PhamaCiaKX16装柱器装成300*16毫米色谱柱。色谱柱用10个床体积的PH5.56，20Inlnol/LtriS.HCL溶液平衡。将前述抽提悬浮液5毫升注入平衡好的SephadexG巧色谱柱，收集活性洗脱峰。浙江大学博士学位论文2.3 DEAE阴离子交换色谱分离量取180毫升DEAE Sephadaeel填料，用KX16/26装柱器(PhamaCia公司)，一次性装入KX26/250空柱，接上Pslo泵，流量控制在sml/L。色谱条件:A液:20InM TriS.HCI PHS.56。B液:20InM TriS.HCL PHS.56含IM NaCIJ。检测波长:280nm。活性组分洗脱条件:15%B。将第一次洗脱的活性峰过柱，以EIJISA法检测活性，收集活性峰。2.4 ELISA法检测生物活性:将待测样品80闪于5倍浓度包被液20闪混合包被到EL工SA反应条中，37℃2小时，4℃过夜。次日用2%脱脂奶粉PBST(磷酸盐一Tween一20缓冲液37℃封闭30分钟。加入SIGMA的兔抗人的EGF抗体，IOOul/孔。(抗体原液作1:1000稀释)37oC，1.5小时。PBS洗涤3次，每次3分钟，加入酶标羊抗兔IgGIOO。1/孔37℃反应1小时。PBS洗涤3次，每次3分钟，加入邻苯二胺一双氧水底物缓冲液，100 ul/孔，37℃反应20分钟。每孔加入SOu12M硫酸终止反应，读取OD49Onm。2.5生物学活性的鉴定(1) MTT法测定EGF活性:取小鼠肾细胞作原代培养，其贴壁细胞用胰酶消化分散，用含10%小牛血清的1640培养基，于37℃，50k二氧化碳培养箱内培养48小时，收集细胞，用Hanks液洗涤，用新鲜培养基稀释至细胞数5X 10’个/ml。取96孔板，每孔加细胞液150/ul、待测样品IOOul，每样品作5个复孔。一组仅加HankS液10Oul作空白对照。37℃、5%二氧化碳条件下培养12小时后，每孔加MTT(smg/m1)15ul继续培养4小时，最后加异丙醇100。1终止反应，在酶标仪上57Onm波长下测吸光度A值，按下式计算生长促进率:生长促进率=(Ai一Ao)/(Ao)100%Ai为各测定孔的A值;Ao为空白对照的A值。(3)新生小鼠睁眼萌齿实验观察组小鼠每天皮下注射EGF170pg/1 00pl/只，对 浙江大学博士学位论文照组每天皮下注射同体积的生理盐水，每天观察睁眼及萌齿情况。3.实验结果3.1 EGF含量的测定:领下腺冻干粉143.摊，活性组份洗脱峰体积为SOml，根据2 8 onm及2 6 Onm测定的