研究背景及目的：乳腺癌是威胁着全球女性的健康的常见恶性肿瘤。放射治疗在乳腺癌的治疗中占据着重要地位,是使用广泛,临床获益显著的治疗手段,可以降低乳腺癌局部肿瘤复发风险和死亡率。然而,由于新生血管形成速度和恶性肿瘤细胞增殖速度的不平衡,大部分实体瘤内部都存在一定的乏氧区域,存在于乏氧区域的肿瘤细胞一般被称作乏氧肿瘤细胞,这些细胞常有显著的辐射抵抗性。难以被彻底清除的乏氧肿瘤细胞,常常是造成实体瘤晚期发生转移的一个重要原因。局部乏氧的微环境是实体瘤的重要特征之一,然而在正常组织中却罕见乏氧区域。因此特异性地增加乏氧肿瘤细胞的辐射敏感性是一个提高乳腺癌的放射治疗效果的理想途径。p53是一个常见的抑癌基因,对肿瘤细胞的放射敏感性起着重要的调节作用,在多种恶性肿瘤中,p53的功能缺失会引发对辐射的抵抗。有研究报导,在乏氧的情况下,野生型p53的肿瘤细胞比敲除p53基因的肿瘤细胞对辐射更敏感,因此乏氧微环境中p53缺失的肿瘤细胞更易存活。而且在某些肿瘤细胞系中,乏氧处理会抑制p53的功能,从而导致细胞对辐射的敏感性减弱,而再激活p53则可以增加乏氧肿瘤细胞的放射敏感性。由于乏氧区域很少出现在正常组织当中,因此可以靶向乏氧肿瘤细胞的p53融合蛋白可能是一种新颖有效的辐射增敏剂。线粒体自噬,是线粒体上发生的一类自噬作用,是细胞在某些刺激因素（如低氧、饥饿、氧化应激等）刺激下,细胞中损伤和老化的线粒体被自噬小体特异性吞噬,并被溶酶体降解的过程。Parkin蛋白是线粒体自噬过程中一个重要的调节因子, Parkin蛋白被特异性地募集到膜电位低的受损线粒体上,并进一步介导受损线粒体被自噬小体吞噬降解。最近有研究发现乏氧可以诱导Parkin蛋白介导的线粒体自噬,降解受损的线粒体,从而维持细胞的稳态。而过去的研究发现自噬参与肿瘤细胞对辐射产生抵抗的过程,因此,我们推测Parkin介导的线粒体自噬可能参与了乏氧细胞的辐射抵抗反应。研究发现p53既可以在核内作为转录因子调节自噬,也可以通过核外非转录途径对自噬进行调节,而这一途径的作用机制尚研究甚少。近年来有研究发现,在正常组织细胞中,p53可以抑制线粒体自噬,在鼠的心肌和胰腺β细胞中,胞质p53可以通过与Parkin蛋白结合阻断线粒体自噬的进程。然而在肿瘤细胞中p53如何调节线粒体自噬还未有研究。在我们的前期研究中,我们构建了一个新型融合蛋白载体,TAT-ODD-p53,包含人野生型p53蛋白、蛋白转导结构域多肽（TAT47₅7）,以及缺氧靶向稳定性结构域多肽（ODD557-574）,并成功地进行了蛋白的表达和纯化。同时,我们也合成了其对照蛋白：p53, TAT-p53和TAT-ODD-EGFP。TAT-ODD-p53可以通过TAT多肽区域的作用成功进入肿瘤细胞,同时,在ODD多肽区域的作用下选择性地在乏氧肿瘤细胞中稳定存在。我们在体外和体内实验中验证了TAT-ODD-p53在乏氧条件下对乳腺癌细胞的靶向辐射增敏作用,并阐明其作用机制。我们的研究发现,TAT-ODD-p53可以靶向乏氧的乳腺癌细胞,并通过阻断Parkin介导的线粒体自噬以增加其辐射敏感性。方法：1.体内、体外实验验证融合蛋白TAT-ODD-p53在不同氧浓度的乳腺癌细胞中的稳定性1.1乳腺癌细胞培养人乳腺癌细胞株MCF-7（p53野生型）,和人乳腺癌细胞株MDA-MB-157（p53缺失型）用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基在37℃、5%CO2的条件下进行培养。1.2融合蛋白合成构建TAT-ODD-p53, TAT-p53,p53 and TAT-ODD-EGFP的质粒。通过质粒表达和纯化获得相应的融合蛋白,获得的融合蛋白溶解于50 mM PBS中,在-80℃保存六个月内使用。1.3细胞乏氧处理使用Forma 1029厌氧培养箱,在37℃、0.5%O2和5%CO2的条件下对细胞进行乏氧处理。并且在使用融合蛋白或辐照处理前,细胞需在乏氧条件下培养8小时。1.4 Western blot实验提取待检测细胞的总蛋白,采用BCA法来测定相应蛋白浓度,接着进行蛋白变性反应,然后使用准备好的蛋白进行电泳、转膜、封闭步骤,并孵育相应的一抗和二抗,最后在显影仪上采用ECL法进行显影。1.5荷瘤鼠模型将MDA-MB-157细胞用无菌生理盐水重悬制成细胞悬液,将细胞数调整为1×107个/ml。选择6-8周龄的正常雌性Balb/c裸鼠,将接1x107个细胞接种在裸鼠右侧乳房脂肪垫下。为了观察p53融合蛋白的稳定性和分布情况,当肿瘤长至200 mm3左右时,将1 mg/kg的p53融合蛋白进行裸鼠腹腔注射,每天一次连续注射5天后取瘤体标本进行观察,在裸鼠处死前1h腹腔注射pimonidazole （60 mg/kg）以标记肿瘤内的乏氧区域。1.6组织免疫荧光将所取肿瘤组织放在使用干冰预冷后锡箔纸上,待组织冷冻以后放置于-80℃冻存。取冻存组织制备冰冻切片,依据乏氧探针试剂盒（HypoxyprobeTM-1 Kit）说明书操作进行荧光染色,同时进行p53蛋白荧光染色,切片用激光共聚焦荧光显微镜进行观察。2.体外实验验证TAT-ODD-p53融合蛋白对乏氧乳腺癌细胞的辐射增敏作用2.1细胞毒性实验使用MTT比色法,测定通过p53融合蛋白对MCF-7和MDA-MB-157乳腺癌细胞的细胞毒性,以此作为后续实验使用的蛋白浓度的参考。消化对数生长期状态良好的乳腺癌细胞,制成单细胞的悬浮液后,均匀接种在96孔板中并培养过夜。第二天分别在常氧和乏氧条件下加入梯度浓度（0,2,4,8,16,32 μg/ml）的融合蛋白孵育72 h,接着在每孔中加入5mg/mL的MTT,充分混匀并继续孵育4h,在弃掉上清液之后向每孔中加入150ul二甲基亚砜,最后使用酶标仪来检测吸光值（A570nm）。2.2克隆形成实验将对数生长期的乳腺癌细胞消化制成单细胞悬液,按0、2、4、6、8五个剂量组照接种相应数量的乳腺癌细胞于6孔板中培养过夜。使用6-MV的X射线对贴壁细胞进行照射后,继续培养10-14天,直到培养出肉眼可以见的克隆,将细胞用甲醇固定后,加入1%的结晶紫乙醇溶液进行细胞染色,使用显微镜计算克隆（含有50个细胞以上）数目。统计数据,计算克隆形成率和存活分数,依据多靶单击进行生存曲线拟合,并通过模型计算辐射增敏比值SER和氧增强比值OER。2.3流式细胞检测分析检测细胞凋亡在6孔板中接种5×105个／孔密度的细胞,镜下观察细胞的汇合度达到大约80%左右时进行处理。细胞照射继续培养24小时后收集细胞检测凋亡。采用Annexin V-FITC/PI细胞双染法对细胞进行荧光染色,并使用流式细胞仪来检测相应的荧光标记。3.体内实验验证TAT-ODD-p53融合蛋白的辐射增敏作用3.1肿瘤生长抑制试验当肿瘤长至200mm3左右时,将1mg/kg的p53融合蛋白进行裸鼠腹腔注射,每天注射一次,连续处理5天,最后一次注射后进行单次剂量10 Gy的照射。使用游标卡尺测量肿瘤的大小,每3天测量一次,肿瘤体积依据公式V=（axb2）/2来进行计算,a和b分别代表最长径和最短径。3.2 TUNEL法检测组织凋亡在裸鼠照射后7天取肿瘤组织进行冰冻切片,根据In Situ Cell Death DetectionKit试剂盒的操作说明,通过原位末端标记（’TUNEL）法检测各组织标本中的凋亡情况,用DAPI荧光试剂复染细胞核后,使用荧光显微镜来观察并计算凋亡细胞数。4. TAT-ODD-p53融合蛋白对乏氧乳腺癌细胞辐射增敏作用机制的研究4.1构建稳定表达GFP-LC3的MDA-MB-157细胞在6孔板中接种密度5×105个／孔的MDA-MB-157细胞,待细胞达到40%左右密度时,分别加入MAP1LC3B以及阴性对照LV5-NC慢病毒悬液（MOI=20）,同时选择2孔加入polybrene （6ug/ml）以增加感染效率,培养24h后更换细胞培养基,再继续培养72h,使用荧光显微镜拍照并计算细胞感染效率。接着通过流式细胞仪将GFP表达阳性的细胞分选出来,从而得到GFP阳性比例较高的细胞,并继续扩大培养,最终得到可以稳定表达GFP-LC3的乳腺癌细胞。4.2 siRNA和plasmid的转染依据lipofectamine 2000试剂的操作说明,使用阳离子脂质体法对细胞进行转染,细胞接种后用无血清培养基来培养细胞,当接种细胞的融合度达到70%左右时,将siRNA或者plasmid用转染专用培养基Opti-MEMI Reduced Serum Medium稀释,同样的,将lipofectamine 2000用转染专用培养基Opti-MEMI Reduced Serum Medium稀释后,与siRNA或者plasmid的稀释溶液充分混合后,在室温下条件静置20min,将混合液加入细胞培养板中小心混匀。将处理后的细胞继续培养4-6h后,可置换培养基为含血清培养基,再将细胞继续置于细胞培养箱中培养,进行后续实验。4.3免疫荧光共定位实验将5×104个稳定表达GFP-LC3的MDA-MB-157细胞接种在共聚焦培养皿中培养过夜,然后将细胞分别置于常氧（20%02）和乏氧（0.5%O2）条件下培养8h,接着对细胞进行6 Gy剂量的照射,然后继续培养6h,用4%的多聚甲醛进行细胞固定,加入200 nM的MitoTracker Red对线粒体进行染色,并用DAPI荧光试剂复染细胞核,最后使用激光共聚焦显微镜进行扫描和观察。4.4透射电镜实验将5×105个细胞接种在培养皿中培养过夜,然后将细胞在乏氧条件下培养8h,细胞接受6 Gy的照射6h后,立即置于含2%的多聚甲醛和2.5%的戊二醛固定液中进行固定。使用振动切片机制作50μm厚度的切片,用1%的四氧化锇孵育切片1h进行后固定,通过乙醇梯度脱水后将切片嵌入环氧树脂中。80℃孵育24 h完成聚合反应,最终制成100 nm的超薄切片,使用透射电镜进行观察。4.5 mtDNA分析实验首先根据Universal Genomic DNA Extraction Kit说明书步骤获得基因组DNA,接着使用SYBR（?） Premix Ex TaqTM kit试剂盒,依据试剂盒操作步骤来进行荧光定量PCR反应。基因表达水平通过标准曲线法校正,计算nt-Atp6/Rp113相对表达量。4.6 qRT-PCR实验首先使用rizol Reagent试剂获得细胞总RNA,然后依据PrimeScript （?） RT reagent kit操作步骤来进行逆转录反应,获得实验所需的cDNA;以上一步实验获得的cDNA为模板,使用SYBR（?） Premix Ex TaqTM kit试剂盒,依据试剂盒操作步骤来进行荧光定量PCR反应,以检测目的mRNA的表达水平。4.7免疫共沉淀使用PARIS kit提取胞质蛋白,接着采用Pierce Co-Immunoprecipitation Kit;进行免疫共沉淀反应,将裂解液与含有10 μg一抗的共价交联树脂置于4℃孵育过夜,共沉淀产物洗脱后进行Western blot分析。5.统计分析使用SPSS 13.0软件进行统计分析,实验数据以均数±标准差（mean±SD）的形式表示,组间采用两样本t检验（Independent-Sample t-test）进行比较。P值<0.05认为有统计学意义。结果：1.体外实验证明TAT-ODD-p53特异稳定存在于乏氧乳腺癌细胞中用pbs或10μg/mlp53融合蛋白处理p53缺失型乳腺癌细胞MDA-MB-157,分别在常氧（20%02）和乏氧（0.5%02）条件下孵育8h后,用Western blotting检测p53蛋白表达水平。只有TAT-p53或TAT-ODD-p53融合蛋白处理的细胞中有p53蛋白表达,说明p53融合蛋白是通过TAT结构域成功转入细胞。TAT-p53处理的细胞中p53蛋白在常氧和乏氧条件下都有表达,而只有TAT-ODD-p53可以特异性的在乏氧乳腺癌细胞中稳定存在,而在常氧乳腺癌细胞中快速降解。2.体内实验证明TAT-ODD-p53特异稳定存在于乳腺癌乏氧区域使用免疫荧光共定位的方法分析荷瘤小鼠模型中TAT-ODD-p53与乏氧标记pimonidazole的表达,发现TAT-ODD-p53的表达与乏氧探针pimonidazole的表达区域具有一致性,说明TAT-ODD-p53可以特异性的稳定存在于乳腺癌肿瘤组织中的乏氧区域。3.检测TAT-ODD-p53的IC50值为了后续实验选择合适的蛋白浓度,我们在不同氧浓度条件下,使用梯度浓度的TAT-ODD-p53蛋白处理乳腺癌细胞,通过MTT法检测TAT-ODD-p53蛋白的细胞毒性作用,并计算其IC50值。TAT-ODD-p53只有在乏氧条件下有显著抑制肿瘤细胞增殖的作用,而p53缺失型乳腺癌细胞MDA-MB-157与p53野生型乳腺癌细胞MCF7细胞的ICso值分别为4.00 μg/ml和12.85 μg/ml。4. TAT-ODD-p53对乏氧乳腺癌细胞的辐射增敏作用不同氧浓度条件下,通过克隆形成实验数据计算得到MCF7与MDA-MB-157细胞的氧增强比（OER）分别为1.91和2.43,说明乏氧条件下乳腺癌细胞产生了明显的辐射抵抗。而乏氧条件下MCF7与MDA-MB-157细胞在4.00 μg/ml的TAT-ODD-p53处理1小时后的放射增敏比（SER）分别为1.55 and 2.24,表明TAT-ODD-p53提高了乏氧乳腺癌细胞的辐射敏感性,减轻了乏氧条件下乳腺癌细胞的辐射抵抗。同时通过流式分析检测发现和western blot检测TAT-ODD-p53处理乏氧乳腺癌MDA-MB-157细胞后凋亡明显增加,这也证实了TAT-ODD-p53对乏氧乳腺癌细胞的辐射增敏作用。5.体内实验证明TAT-ODD-p53对乏氧乳腺癌细胞的辐射增敏作用建立MDA-MB-157移植瘤小鼠模型,使用PBS或TAT-ODD-p53 （1 mg/kg）处理后进行单次剂量10Gy的X线照射,观察瘤体长到预期最大体积（600 mm3）.的时间。在未照射组,使用PBS或TAT-ODD-p53处理后瘤体生长时间分别为14和18天,在照射组二者分别为21和32天。说明TAT-ODD-p53联合照射组的瘤体生长速度显著减缓。而TAT-ODD-EGFP对裸鼠肿瘤的生长并没有抑制作用也没有提高肿瘤的放射敏感性,说明TAT-ODD本身并没有抗肿瘤作用。同样的,通过TUNEL法检测瘤体组织的凋亡情况,发现在TAT-ODD-p53联合照射组的凋亡率明显增加。6.乏氧条件下乳腺癌细胞中线粒体自噬增加线粒体通过自噬作用被清除的这一个过程称作线粒体自噬,是维持线粒体稳态的一个重要步骤。通过自噬标记蛋白LC3与线粒体标记物MitoTracker的荧光共定位可以用来评估线粒体自噬。在乏氧条件下,稳定表达GFP-LC3的MDA-MB-157细胞中的荧光共定位数明显增加。同时,透射电镜也可以观察到,在乏氧条件下,MDA-MB-157细胞内被自噬小体包裹的线粒体数量增加。这些结果表明乏氧可以促进乳腺癌细胞线粒体自噬的发生,并在受照射后持续存在。为了进一步验证这个结论,我们通过real time PCR检测了以基因组DNA Rp113作为内参的线粒体DNA （mtDNA）标志物mt-Atp6的相对表达量,这一数据可以反映细胞内线粒体含量。结果表明,mtDNA含量在乏氧的受照射细胞中明显减少,并且在干扰了自噬相关蛋白Atg7阻断自噬过程后不再出现mtDNA含量的显著减少。提示在乏氧条件下,线粒体可以通过线粒体自噬过程被清除。7. TAT-ODD-p53可以通过抑制乏氧诱导的线粒体自噬增加乳腺癌细胞放射敏感性在加入TAT-ODD-p53干预后,乏氧条件下MDA-MB-157细胞中荧光共定位数量减少,并且mtDNA含量增加。而在p53野生型乳腺癌MCF7细胞中,干扰p53的表达可以明显增加乏氧条件下荧光共定位数量,并且mtDNA含量减少,这些结果说明TAT-ODD-p53可以抑制乏氧条件下乳腺癌细胞线粒体自噬的发生。克隆形成实验显示,干扰Atg7阻断线粒体自噬进程后,MDA-MB- 157细胞的SER为1.93,放射敏感性增加。而TAT-ODD-p53 处理组乏氧 MDA-MB-157细胞的SER值在Atg7被干扰后由2.26下降到1.27,说明TAT-ODD-p53的增敏作用在线粒体自噬过程被阻断后明显减弱,提示TAT-ODD-p53对乏氧乳腺癌细胞的增敏作用至少有一部分是通过抑制线粒体自噬来产生。8. TAT-ODD-p53可以通过Parkin通路抑制线粒体自噬在乏氧MDA-MB-157细胞中干扰Parkin表达后,线粒体自噬的荧光共定位数量减少,同时mtDNA含量增加,说明被线粒体自噬的清除作用减弱。提示乏氧条件下诱发了Parkin介导的线粒体自噬。过表达Parkin可以减弱TAT-ODD-p53对乏氧MDA-MB-157细胞线粒体自噬的抑制作用,线粒体含量相应的有所增加。在乏氧MCF7 ceils干扰p53后线粒体自噬显著增加,而敲除Parkin后p53敲除对线粒体自噬的诱导也显著减弱。说明在乏氧条件下TAT-ODD-p53可以通过Parkin通路抑制线粒体自噬的发生。9. TAT-ODD-p53可以在胞质中与Parkin结合抑制其线粒体转位qRT-PCR和western blot实验显示p53并没有影响Parkin的表达水平,而是减少了乏氧乳腺癌细胞中Parkin定位在线粒体上的含量。在TAT-ODD-p53处理后,乏氧MDA-MB-157细胞线粒体上Parkin的蛋白含量明显减少。而在干扰p53后,乏氧MCF7细胞线粒体上Parkin的蛋白含量明显增加。并且TAT-ODD片段本身并不能改变Parkin的定位情况。进一步通过免疫共沉淀实验发现,在TAT-ODD-p53处理的乏氧MDA-MB- 157细胞以及p53野生型的MCF7细胞中,p53和Parkin蛋白都可以直接结合。10. Parkin蛋白介导的线粒体自噬参与TAT-ODD-p53对乏氧乳腺癌细胞的辐射敏感作用在过表达Parkin蛋白后,TAT-ODD-p53对乏氧乳腺癌细胞MDA-MB- 157的辐射增敏作用明显减弱。而在敲除ATG7抑制线粒体自噬进程后,再过表达Parkin蛋白便不再有增加辐射抵抗的作用。这些结果提示TAT-ODD-p53对乏氧乳腺癌细胞辐射增敏作用至少有一部分是通过抑制Parkin蛋白介导的线粒体自噬来实现。结论：1.体内外实验证明TAT-ODD-p53特异稳定存在于乏氧乳腺癌细胞中。2.体外、体内实验中证明TAT-ODD-p53可增加乏氧乳腺癌细胞的辐射敏感性。3.TAT-ODD-p53通过抑制线粒体自噬从而增加乏氧乳腺癌细胞的辐射敏感性。4.TAT-ODD-p53通过结合Parkin蛋白阻断其线粒体转位从而抑制乏氧诱导的线粒体自噬。5.TAT-ODD-p53可以通过抑制Parkin蛋白介导的线粒体自噬而增加乏氧乳腺癌细胞辐射敏感性。