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目的从弓形虫Prugniaud(PRU)株总DNA中克隆BSR4基因片段,构建pET28a(+)-BSR4重组表达质粒;对比不同虫株之间BSR4基因序列,进行生物信息学分析;在原核表达系统中表达BSR4,纯化表达产物并检测其免疫反应性,为弓形虫病的免疫诊断和疫苗研制以及致病机制的研究奠定基础。方法用本实验室保种的弓形虫PRU株腹腔接种昆明鼠,取脑组织匀浆,用小鼠淋巴细胞分离液纯化弓形虫包囊,提取弓形虫PRU株的基因组DNA,根据GenBank中已知弓形虫ME49株BSR4基因序列设计合成引物,在引物中引入NcoI和HindⅢ酶切位点。应用PCR技术从弓形虫PRU株基因组DNA中扩增BSR4基因。PCR产物经胶回收纯化后用限制性内切酶NcoⅠ和HindⅢ切下目的片段,以相同的酶切位点通过T4连接酶亚克隆入pET28a(+)载体中构建重组表达质粒pET28a(+)-BSR4,采用双酶切及测序方法鉴定重组质粒。采用生物信息学方法对BSR4蛋白的理化性质、同源性分析以及二级结构和抗原表位进行预测。将重组质粒pET28a(+)-BSR4转化至表达宿主菌BL21(DE3)中,挑取单个菌落,培养扩增至OD600约为0.5,加IPTG诱导表达,超声破壁后,分离上清和沉淀,SDS-PAGE电泳分析表达产物,对沉淀中的包涵体经8M尿素溶解,His Trap Ni亲和层析柱纯化重组蛋白,Western-Blottting鉴定重组BSR4蛋白的免疫反应性。改良Bradford(考马斯亮蓝)法测定纯化蛋白浓度。用小鼠淋巴细胞分离液分离感染及未感染弓形虫小鼠脾细胞,以纯化抗原刺激小鼠脾细胞的生长,48h后加入3H-TdR,继续培养24h,检测小鼠脾细胞淋巴细胞增殖水平。结果PCR体外扩增得到目的基因片段长约1194bp,测序结果表明,获得弓形虫BSR4基因片段。经BLAST同源性对比显示,弓形虫PRU株和ME49株基因序列同源性为100%,是高度保守的序列。双酶切及测序结果显示目的基因己被正确地连接入重组质粒pET28a(+)中。生物信息学分析表明,BSR4蛋白相对分子量为42344.75,有2个功能结构域,氨基酸序列的前40位为信号肽序列,N端为信号肽,C端为疏水序列,预测它为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白,存在18个潜在抗原表位及2个保守功能区域。重组质粒pET28a(+)-BSR4经IPTG诱导在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,超声破菌后SDS-PAGE电泳分析取上清和沉淀,结果表明重组蛋白在37℃时大量表达,以包涵体的形式存在。表达蛋白经尿素溶解,His Trap Ni亲和层析柱纯化,得到可溶性蛋白。Western-blotting检测可发现一特异性蛋白区带,分子量约为45kDa,该条带能被弓形虫慢性感染血清识别。淋巴细胞增殖实验表明,感染弓形虫小鼠刺激指数(SI)明显高于未感染组。结论从弓形虫PRU株中克隆出缓殖子期特异性抗原BSR4基因编码序列;成功构建了目的基因BSR4的重组质粒pET28a(+)-BSR4,在大肠埃希菌BL21中以包涵体形式高效表达了BSR4目的基因片段;该产物具有特异的免疫反应性,在体外可刺激记忆性淋巴细胞明显增殖。推测BSR4可能是具有良好应用前景的弓形虫候选疫苗分子,还有望应用于弓形虫慢性感染的检测。