研究背景与目的白血病是一类严重危害人类健康的造血系统恶性肿瘤,主要以造血干细胞恶性增殖为特点,是儿童及青少年发病率和死亡率最高的肿瘤之一。近年来,随着人们对白血病生物学特性认识的不断加深,对其相关的诊断和治疗手段取得了显著的提高。但是,由于白血病复发率较高,且复发后的白血病较初治患者而言,治疗的难度大大增加,导致其长期无病生存率仍然较低。此外,由于白血病的常规治疗方法目前仍然以化疗为主,而化疗药物在缓解病情的同时往往对病人造成了不同程度的副反应,包括骨髓抑制、胃肠道反应、肝肾损伤、免疫功能受损等。同时,白血病诊断的主要依据是骨髓或外周血中的细胞形态学检查和细胞化学分析,包括:染色体核型分析、免疫学检测(流式细胞术)、荧光原位杂交技术和PCR技术等。然而,这些方法均不能实现对白血病细胞的直接检测。鉴于当前白血病的诊断和治疗方法中存在的问题和缺陷,急需发展一种针对白血病细胞具有特异性识别能力的靶向策略,用于白血病的靶向治疗以及对白血病细胞动态监测,尤其是对治疗后微小残留病灶的监测。近年来,随着肿瘤靶向诊断和治疗策略研究的深入,针对白血病细胞的靶向策略正逐渐成为白血病研究中的新热点,并得到了广泛的关注。目前关于白血病治疗的靶向策略主要包括:基于单克隆抗体、基因突变、表观遗传修饰和肿瘤相关调控的信号通路。然而,由于白血病细胞基因组本身的复杂性和恶性细胞异质性,导致这些靶向策略只能针对特定类型的白血病细胞,影响了其临床应用前景。大量研究证实,缺氧微环境作为绝大多数实体肿瘤的基本特征之一,对肿瘤细胞基因不稳定性、细胞代谢调控、肿瘤耐药性、肿瘤血管生成以及肿瘤侵袭转移等均具有调控作用,是肿瘤靶向研究的重要策略。目前,关于肿瘤细胞缺氧的靶向策略主要是针对缺氧调控的细胞和缺氧诱导因子HIF-1α相关的信号调控通路。另外,线粒体作为细胞中功能最重要的细胞器之一,在不同生理和病理状态下对细胞的生存和死亡调控都发挥着重要作用。在相关研究中发现,与正常细胞相比,白血病细胞的线粒体具有很多特殊性,包括:细胞内数量更多,更加依赖于线粒体氧化磷酸化和脂肪酸氧化功能提供能量等。在本课题组的前期研究中,发现了一类具有近红外荧光特性的七甲川花菁类小分子IR-780,其在体内外实验中被证实对多种人类肿瘤细胞均表现出良好的肿瘤选择性,而且能够特异性地蓄积于肿瘤细胞的线粒体中。然而,这类荧光小分子由于具有长共轭的强疏水性的七甲川链,导致其在水溶液中容易聚集,影响其对血液中肿瘤细胞的靶向特性。为了进一步提高该类荧光小分子的生物相容性和临床应用潜能,我们通过在IR-780的N-烷基侧链上进行水溶性氨基酸基团修饰的方法,成功地合成了一类新型的七甲川花菁类荧光小分子,并研究其对血液肿瘤细胞和循环肿瘤细胞(CTCs)的靶向作用,初步探索了其对白血病细胞的可能的靶向作用机制,为白血病的诊断和治疗提供了新的靶向策略,同时对进一步揭示白血病生物学特性和循环肿瘤细胞在肿瘤的发生、发展及肿瘤转移过程中的意义,提供了新的参考。主要研究方法与结果,包括以下四部分:1.甘氨酸修饰的IR-780衍生物NIR-26和NIR-27的合成、鉴定及生物学活性的研究。通过在IR-780的N-烷基侧链上进行水溶性氨基酸基团修饰的方法,合成了一类新型七甲川花菁类荧光小分子NIR-26和NIR-27,并对其结构进行了鉴定;同时评价了NIR-26和NIR-27的光学特性和水溶性。进一步研究了NIR-26、NIR-27在小鼠体内的分布和代谢情况,及其对大鼠的急性毒性。主要的研究结果如下:1.1通过在IR-780的N-烷基侧链上进行水溶性氨基酸基团修饰的方法,分别获得化合物NIR-26和NIR-27,其不但保留了IR-780和ICG的近红外特性,还显著提高了IR-780类似物的水溶性。其中,NIR-26的水溶性比IR-780提高了至少20000倍。这说明在化合物结构中引入氨基酸或氨基酸酯基团等结构修饰,可获得具有较好水溶性的新型七甲川花菁类荧光小分子。1.2通过测试NIR-26和NIR-27在甲醇、PBS和血清(100%FBS)三种溶剂中的吸收和发射光谱图可知,NIR-26和NIR-27保留了IR-780荧光特性且均位于近红外光谱范围,其在血清中的稳定性较好。同时发现NIR-26的水溶性较IR-780得到了很大改善,且荧光强度明显高于ICG和NIR-27,说明NIR-26具有成为生物体内标记和活体显影的近红外荧光探针的潜力。1.3通过NIR-26和NIR-27在正常小鼠体内的分布及代谢实验可知,该类荧光小分子的代谢途径可能是经静脉注射后,全身分布并随血循环快速分布于肝脏、肾脏等代谢脏器。进一步根据小鼠24 h的粪便中存在较强的荧光信号可知,该类荧光小分子有可能是由肝脏通过胆汁分泌排出体外。1.4通过NIR-26和NIR-27的大鼠急性毒性实验,发现注射100倍标记剂量的NIR-26和NIR-27后,SD大鼠的一般状况良好、体重无明显减轻,血、生化指标未见异常改变,进一步观察大鼠各组织器官切片均未发现明显的异常改变,说明该类小分子在本实验条件下对大鼠无明显急性毒性作用。2.分别建立白血病细胞的裸鼠荷瘤模型和人白血病细胞小鼠模型,研究七甲川花菁类荧光小分子NIR-26对白血病细胞的靶向特性,并将双通道活体流式细胞仪应用于研究NIR-26对白血病细胞的靶向特性。主要的研究结果如下:2.1在GFP标记的HL-60细胞裸鼠皮下荷瘤模型上,证明了NIR-26对白血病细胞具有明显的靶向性和近红外成像特性,并且能够与GFP荧光共定位于肿瘤组织中。进一步对模型小鼠的主要脏器和肿瘤组织进行离体成像,显示肿瘤组织的NIR荧光信号强度明显高于其它器官,且NIR与GFP荧光能够很好的共定位于肿瘤组织。通过激光共聚焦显微镜观察肿瘤组织冰冻切片,发现了NIR与GFP荧光能够很好的共定位。在Jurkat和K562细胞建立的裸鼠皮下荷瘤模型上,同样验证了NIR-26的肿瘤靶向作用和近红外成像特性。2.2通过对60Coγ射线全身照射后的C57BL/6小鼠尾静脉注射GFP标记的HL-60细胞的方法,建立了人白血病细胞小鼠模型,并使用活体流式细胞仪对该模型小鼠外周血中的HL-60细胞进行实时动态监测,发现HL-60细胞能够较长时间的存在于小鼠循环系统内,且其数量在一定范围内发生波动。进一步对模型小鼠的各重要脏器和外周血进行观察,发现白血病细胞主要存在于骨髓,且在外周血中有一定的分布,同时在脾脏和肝脏等器官中也有不同程度的细胞浸润,证明了该种方法可以建立全身扩散的人急性骨髓性白血病细胞小鼠模型。2.3首次成功建立并使用双通道(488 nm和785 nm)的活体流式细胞仪,对白血病模型小鼠外周血中的两种荧光信号同时进行监测,发现在尾静脉注射NIR-26后的第10天,NIR荧光细胞的信号峰与GFP荧光细胞的信号峰重合情况较好,且双标细胞的数量达到GFP荧光细胞总数的89.74%,说明NIR-26在注射之后的第10天对循环系统中的HL-60细胞有明显的靶向作用。进一步将从模型小鼠外周血提取的PBMCs细胞涂片、股骨和脾脏的冰冻切片分别置于激光共聚焦显微镜下观察,发现NIR与GFP荧光共定位较好,证明了NIR-26对小鼠体内的人白血病细胞具有靶向作用和近红外成像特性。3.研究了七甲川花菁类荧光小分子NIR-26对白血病细胞的体外靶向作用,并初步探索了其可能的靶向作用机制。主要的研究结果如下:3.1以不同浓度和不同时长的标记条件,用NIR-26分别对PBMCs和HL-60细胞进行标记,经检测发现在5μM,20 min的标记条件下,HL-60细胞的荧光信号显著高于正常人的PBMCs细胞,进一步在其它两种白血病细胞Jurkat和K562中进行验证,同样发现PBMCs与Jurkat和K562细胞的荧光信号强度有显著性差异。选定该标记条件作为NIR-26体外标记细胞的最适条件。3.2将GFP标记的HL-60细胞和正常人的PBMCs按照约1:1的比例混合,模拟临床白血病患者的外周血情况,然后用NIR-26(5μM,20 min)进行标记,发现NIR-26能够特异性地识别混合在PBMCs中具有GFP荧光的HL-60细胞,表明NIR-26能够特异性地识别外周血中的白血病细胞。3.3分离提取了白血病患者和健康志愿者的单个核细胞,用NIR-26(5μM,20 min)标记并细胞涂片后,观察发现与健康志愿者比较,NIR-26能够识别白血病患者单个核细胞中的一群异常细胞,荧光信号强度明显高于其它细胞,说明NIR-26能够特异性地识别临床白血病患者外周血中的白血病细胞。3.4在机制研究中,观察发现NIR-26通过依赖能量的主动转运方式进入白血病细胞。使用缺氧培养条件和OATPs转运体抑制剂BSP分别处理白血病细胞后,发现缺氧条件能够促进NIR-26进入白血病细胞,而BSP显著抑制了NIR-26进入白血病细胞。进一步分别通过缺氧诱导剂氯化钴(Co Cl2)上调HIF-1α和si RNA抑制HIF-1α的表达,观察到NIR-26进入细胞的量与细胞HIF-1α水平呈正相关,同时HIF-1α直接影响细胞中OATPs转运体的表达水平,揭示了缺氧依赖性HIF-1α/OATPs信号通路参与NIR-26进入白血病细胞的机制。4.进一步研究了NIR-26对实体瘤和循环肿瘤细胞的靶向近红外成像特性,及NIR-26对临床晚期肺癌患者外周血中CTCs的检测情况,主要的研究结果如下:4.1在GFP标记的A549细胞裸鼠荷瘤模型上,NIR-26具有明显的肿瘤靶向和近红外成像特性,并且能够与GFP荧光的肿瘤组织共定位。进一步对模型小鼠的主要脏器和肿瘤组织进行离体成像,显示肿瘤组织的NIR荧光信号强度明显高于其它器官,且NIR与GFP荧光能够共定位于肿瘤组织中。通过激光共聚焦显微镜观察肿瘤组织冰冻切片,发现了NIR与GFP荧光能够很好的共定位。在MKN-45和U251细胞的裸鼠皮下荷瘤模型上,同样验证了NIR-26对肿瘤细胞靶向作用和近红外成像特性。4.2将GFP标记的A549细胞和正常人的PBMCs按照约1:1的比例混合,模拟临床转移性肿瘤患者的外周血情况,然后用NIR-26(5μM,20 min)进行标记发现,NIR-26能够靶向混合在PBMCs中具有GFP荧光的A549细胞,表明NIR-26能够特异性地识别外周血中的循环肿瘤细胞CTCs,并可通过其近红外荧光示踪CTCs。4.3用NIR-26(5μM,20 min)分别标记晚期肺癌骨转移患者和正常人的PBMCs后,通过细胞免疫荧光染色的方法检测外周血中表达Ep CAM的CTCs,在激光共聚焦显微镜下观察发现,NIR-26能够靶向PBMCs中Ep CAM阳性的CTCs,且NIR与GFP荧光共定位较好,表明NIR-26能够靶向临床晚期转移性肿瘤患者外周血中的CTCs。结论:在课题组前期研究工作的基础上,本文通过在IR-780的N-烷基侧链上进行水溶性氨基酸基团修饰的方法,成功地合成一类具有近红外荧光特性,良好的水溶性和生物相容性的新型七甲川花菁类荧光小分子,并将其应用于血液肿瘤细胞和循环肿瘤细胞的靶向识别研究。通过体内外实验,证实了七甲川花菁类荧光小分子NIR-26对白血病细胞的靶向作用,同时发现其选择性地蓄积于白血病细胞的线粒体中。建立了人白血病细胞小鼠模型,成功建立并应用双通道活体流式细胞仪实现了在体条件下对其血液中的肿瘤细胞的实时动态监测,对白血病的早期诊断,抗白血病药物的筛选、疗效及预后的评价均有重要意义。此外,NIR-26对临床晚期肿瘤患者外周血中循环肿瘤细胞CTCs同样具有特异性的靶向作用,为进一步发展基于此类荧光探针用于循环肿瘤细胞的靶向性检测提供了依据和基础。进一步探索了NIR-26对白血病细胞的靶向作用机制,揭示其缺氧依赖性HIF-1α/OATPs信号通路介导NIR-26进入白血病细胞。鉴于缺氧是肿瘤细胞内在的生物学特性,所以通过缺氧依赖性的细胞摄取机制使得NIR-26对靶向异质性肿瘤细胞具有普遍意义,进一步的机制研究为白血病的靶向治疗策略提供了新的参考和依据。