帕金森病(PD)是中老年常见的中枢神经系统退行性疾病,其主要病理变化是患者中脑黑质多巴胺(DA)能神经元进行性损伤或功能受损。目前,细胞移植已成为治疗此类神经系统疾病的新希望,因此,如何在体外获取DA能神经元是进行帕金森病细胞移植和替代治疗的关键所在。近年来,有众多的研究者利用各种干细胞诱导向DA能神经元分化,诱导效果不一。本实验所采用的干细胞为人脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,CB-MSCs)。研究表明:人脐带血中除含造血干细胞外,还含丰富的间充质干细胞,其特点与骨髓间充质干细胞相似,具有自我更新和多向分化潜能。与其它干细胞相比,脐血间充质干细胞具有来源丰富、采集方便、免疫原性弱、细菌污染率低、不涉及伦理学争论等优点,为细胞移植或替代治疗提供了新的种子细胞来源。　　 近年来,研究者们利用各种因子诱导各种干细胞向DA能神经元方向分化,如:BDNF、NT-3、IL、FGF、SHH等,近期研究发现,Pleiotrophin(PTN)亦具有较强的诱导干细胞向DA能神经元分化的作用。PTN是一种具有多种生物活性的分泌性生长因子,在细胞生长、分化及发育过程中具有非常重要的作用。近年来,PTN对神经系统,尤其是DA能神经元的作用,引起越来越多研究者的关注。研究表明:PTN具有促进神经干细胞向酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞分化的作用,并能够提高培养液中L-多巴胺的含量。本课题组前期研究表明,人羊膜上皮细胞条件培养液(amnion epithelia conditioned medium,ACM)可诱导CB—MSCs向DA能神经元样细胞分化,其中,考虑ACM中所含营养因子BDNF、NT-3等在诱导过程中发挥重要作用,阻断ACM中所含神经营养因子BDNF、NT-3等作用后,仍可见诱导CB—MSCs向DA能神经元分化的作用,提示ACM中还含有其它因子。因此,本实验的目的是首先明确羊膜上皮是否具有合成和分泌PTN的作用,进而探讨ACM诱导CB—MSCs向多巴胺能神经元分化的分子机制,为临床寻找治疗PD新的细胞来源提供实验依据。　　 本研究采用沉降红细胞,结合密度梯度离心和贴壁筛选等方法纯化人脐血间充质干细胞；酶消化,结合机械分离法分离人羊膜上皮细胞(amnion epitheliacells,AECs)；免疫荧光和RT—PCR法检测PTN在AECs中的表达；ELISA法检测AECs分泌PTN,即ACM中PTN的含量；实验分为三组:分别加入ACM、重组人PTN(rPTN)作为两诱导组,即ACM组,rPTN组,以加入培养基单纯传代培养的CB—MSCs作为对照,即CON组,诱导48h后,通过免疫荧光、RT—PCR法观察多巴胺能神经元表面标记物TH,DAT和NSE的表达；为探讨PTN的作用机制,检测PTN受体SDC3和ALK在脐血间充质干细胞的表达。　　 结果表明:羊膜上皮细胞表达PTN mRNA和蛋白,ELISA检测可见羊膜培养液上清中PTN含量为299.18±8.12～300.05±8.37pg/ml；分别加入ACM和rPTN于P1(passage1)代CB-MSCs中,诱导48h后,与对照组(CON)比较,可见两诱导组部分细胞伸出突起,类似神经细胞样的形态。检测三组细胞DA能神经元标志物TH,DAT和NSE的表达可见:与对照组相比,TH,DAT和NSE在两诱导组的表达明显增多；需要指出的是,三个标志物在ACM组的表达较单纯rPTN诱导组表达强。为了进一步探讨PTN在诱导过程中发挥作用的机制,应用RT—PCR和免疫荧光方法检测了PTN受体SDC3、ALK在三组的表达,结果显示:受体SDC3和ALK在三组均有表达,与对照组相比,SDC3在两诱导组的表达增强,两诱导组之间比较,SDC3在.ACM组的表达较在rPTN组的表达强。ALK在三组的表达变化不大。　　 综上,在本研究中,得出以下结论:　　 1.羊膜上皮细胞能够表达PTN mRNA和蛋白,并且能分泌PTN因子至羊膜上清培养液中；CB—MSCs具有PTN受体SDC3及ALK的表达。　　 2.ACM及rPTN能够明显促进CB—MSCs向DA能神经元样细胞方向分化,但rPTN的诱导作用不及ACM。　　 3.PTN受体SDC3参与诱导过程,并在其中发挥重要作用。