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第一部分:中国汉族卵巢早衰患者的临床特征及染色体核型分析目的:明确染色体异常在病因不明POF患者中所占比重及遗传学病因筛查对POF患者的重要性。材料与方法:招募2012年10月至2014年6月在浙江大学医学院附属妇产科医院生殖内分泌科门诊就诊的156名汉族POF患者及391名卵巢功能正常的汉族对照妇女,比较两组间临床资料的特点。对POF患者行外周血淋巴细胞G显带法检测核型,分析异常核型与临床特点之间的关系。结果:POF组与对照组相比内分泌异常明显。从临床特征上看,POF患者中原发性闭经占10.9%(17/156);大部分患者在30岁前出现闭经症状。在156名患者中,原发性闭经患者17例,核型异常12例,异常率70.6%;继发性闭经患者139例,核型异常12例,异常率8.6%。原发性闭经患者的染色体核型异常率显著高于继发性闭经患者。X染色体的结构异常占到所有染色体异常的62.5%。结论:染色体核型异常是中国汉族POF患者的重要遗传学病因,X染色体的结构异常更为常见。在POF的患者中,尤其是以原发闭经为首要症状的患者中,染色体核型的检查是必要的。第二部分:卵巢早衰患者基因组拷贝数变异分析目的:发现新的POF遗传学致病因素,明确CNV与POF发病的关系及POF患者CNVs的整体分布特点,探索新的POF致病基因。材料与方法:利用Affymetrix CytoScan HD高通量SNP array平台对前期入组并且已排除核型异常的90例POF患者和90例卵巢功能正常的对照进行全基因组CNVs的检测。在全基因组范围内对POF组和正常对照组的CNVs基本特征及分布特点进行了统计及生物信息学的分析,同时基于病例-对照研究的基本策略与DGV数据库对CNVs与POF的发病进行了关联分析。结果:POF组与对照组CNVs在各染色体的分布无明显差异,但在POF组中,CNVs缺失的检出率高于对照组。人均CNVs的总长度在两组间无明显差异,但POF组人均缺失的CNVs总长度为1412.40 kb,显著大于对照组936.50kb的平均总长度。最终发现5个候选CNVs状态,涉及到4q35.2、7q36.1、22q11.22、17p13.2共 4 个位点,覆 盖 ZNF862、ATP6V0E2-AS1、ATP6V0E2、TOP3B、SPNS3 共 5个基因。结论:中国汉族POF患者人群中不存在特殊的CNVs分布,但是POF患者人群中人均缺失的CNVs长度大于正常人群,缺失CNVs累积作用于整个基因组与致病相关。第三部分:卵巢早衰相关候选基因TOP3B拷贝数变异的验证及致病机制初探目的:验证TOP3B位点CNV与汉族POF发病的相关性,探寻其可能的致病机制。材料与方法:进一步扩大POF组与对照组的样本量,利用Taqman探针进行实时荧光定量PCR检测该位点CNV。同时,对该位点CNV缺失的POF患者利用aCGH平台进一步检测,明确其边界,并对该位点拷贝数缺失的患者进行了 TOP3B全外显子的测序分析,荧光定量PCR检测了外周血中TOP3BmRNA表达水平。利用显微注射siRNA及荧光共聚焦显微镜在下调GV期卵母细胞TOP3B的表达后观察卵母细胞的成熟度;利用体外刺激原代培养的人卵巢颗粒细胞,通过siRNA干扰,实时荧光定量PCR,Western blot,流式细胞术,CCK-8检测了TOP3 表达降低对颗粒细胞的影响。结果:中国汉族人群POF患者TOP3B基因拷贝数异常的发生频率(7/132,5.30%)显著高于汉族人群对照(1/391,0.26%,Fisher’s确切概率法,P<0.05)及DGV大样本人群对照(5/873,0.57%,Fisher’s确切概率法P<0.05)。aCGH平台检测结果与SNParray平台结果一致。两例缺失的患者在rs239927和rs239918位点存在同样的单体型,网站预测对TOP3B的表达起到降调节的作用,其外周血mRNA水平显著低于正常人群。干扰TOP3B的表达,对GV期卵母细胞的成熟能力无明显影响,但可抑制颗粒细胞的增殖于G1期并促进其凋亡,颗粒细胞上与FSH作用相关的基因及受体表达减弱。结论:22q11.22 位点 chr22:22311348～22578983 的 CNV 与 POF 的发病相关,其可通过剂量效应导致所覆盖的TOP3B基因的表达降低,并可通过抑制颗粒细胞的增殖及促进其凋亡来影响卵泡的发育。