由于植物固着生活,因此在它们的一生中需要忍受各种环境胁迫所带来的伤害,例如干旱、高盐、极端温度等。在所有这些胁迫中,干旱胁迫对植物的伤害最大,严重影响了植物的生长发育及地理分布,已成为当前限制作物生产的最主要因素。经过长期进化,植物本身已经拥有了敏感且精细复杂的机制来应答干旱胁迫。完整的干旱响应途径组分包括干旱感受器、信号转导网络、转录调控以及干旱响应蛋白或代谢物的合成,最帮助植物体抵御外界干旱胁迫条件。到目前为止,研究人员已经在拟南芥体内鉴定出两条干旱胁迫响应途径,包括ABA依赖的响应途径和ABA不依赖的响应途径。但是在现阶段,有关植物干旱胁迫响应调节机制的探索还是片段化的,尤其是上游的信号转导组分鲜有报道。促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联途径是一类在真核生物中广泛存在的重要的信号转导网络。经典的MAPK级联途径包括三个必须的激酶组分:MAPKKK、MAPKK和MAPK,通过顺序磷酸化而发挥功能。拟南芥全基因组测序结果显示,拟南芥中约有80个MAPKKK、10个MAPKK和20个MAPK,所有这些成员交叉组合在一起为拟南芥体内的信号转导提供广泛且精细的调控网络。在植物体内,MAPK级联途径在多种生物学过程中都发挥着重要作用,包括细胞分裂、激素响应、体内活性氧平衡调节、植物发育、衰老以及多种生物和非生物胁迫响应过程。本研究探索了拟南芥MAPKKK18基因及其介导的MAPK级联途径在干旱胁迫响应过程中的重要调节作用,主要结果如下:(1)MAPKKK18是拟南芥MEKK家族成员之一,MAPKKK18的T-DNA插入突变体对干旱胁迫超敏感,超表达转基因株系具有更强的干旱胁迫耐受力。(2)叶片失水率检测发现,mapkkk18突变体的失水率要高于野生型而超表达株系的失水率低于野生型。对影响叶片水分蒸发或者失水率的两个主要因素叶片气孔密度和气孔开度分析发现,野生型、突变体和超表达株系莲座叶的气孔密度并没有明显的差别;在正常条件下,野生型、突变体和超表达株系莲座叶的气孔开度也没有差异,但是ABA处理条件下超表达株系的气孔开度要明显小于野生型,而突变体的气孔开度要大于野生型。表明MAPKKK18通过控制气孔开度来影响叶片失水率。(3)qRT-PCR和GUS染色分析表明,MAPKKK18在转录水平可以明显被渗透胁迫和ABA诱导上调,这与MAPKKK18参与干旱胁迫响应一致。但是在aba2和pyr1pyl1pyl2pyl4 ABA受体四突变体中MAPKKK18却几乎不受渗透胁迫诱导,并且在abi1、abi2、abi4和abi5突变体中被诱导的倍数也要明显低于野生型。这表明MAPKKK18的渗透胁迫诱导表达是植物内源ABA和ABA信号途径依赖的。另外,组织表达模式分析表明MAPKKK18在拟南芥根和花序中的表达量明显高于其他组织。(4)为鉴定MAPKKK18下游的靶蛋白,我们利用酵母双杂交进行了MAPKKK18与所有10个MAPKK蛋白的互作分析,结果表明只有MAPKK3可以与MAPKKK18在酵母体内发生互作。免疫共沉淀实验证实二者也可以在体内发生互作。同时蛋白激酶活性检测发现MAPKKK18可以将MAPKK3磷酸化。表明MAPKKK18通过与MAPKK3在体内发生互作并将其磷酸化参与调控拟南芥干旱胁迫响应过程。(5)qRT-PCR分析发现,MAPKK3和MAPKKK18具有相似的组织表达模式。但是MAPKK3在转录水平上并不受ABA、甘露醇和PEG的诱导上调。对mapkk3突变体的抗旱性分析显示,干旱处理后mapkk3突变体的存活率要明显低于野生型,叶片失水率高于野生型,表明MAPKK3是拟南芥干旱胁迫响应的正调因子。(6)为鉴定MAPKK3下游的靶蛋白,利用酵母双杂交分析了MAPKK3与所有20个MAPK的蛋白互作情况,结果表明MAPKK3在酵母体内可以和MAPK1、MAPK2、MAPK7、MAPK13和MAPK14五个MAPK发生互作。因此,我们寻找到了一条参与拟南芥干旱胁迫响应的MAPK级联途径,包括MAPKKK18、MAPKK3以及MAPK1/2/7/13/14。(7)在abi4与abi5突变体中,PEG处理后MAPKKK18的诱导表达量明显低于野生型,表明ABI4和ABI5可能是MAPKKK18上游的转录调节因子。利用烟草叶片瞬时转化分析以及染色质免疫共沉淀分析发现,ABI4和ABI5可以直接结合MAPKKK18的启动子区从而作为其上游的转录激活因子发挥功能。