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依赖随机化末端连结物PCR （Randomized terminal linker-dependentPCR，RDPCR）是以LMPCR为基础，改进LMPCR的不足并建立起来的，可以定位检测任何类型DNA损伤的一种分子生物学方法。该技术在国家自然科学基金的资助下，于2002年成功建立。以后应用该技术检测了多种环境化学物和饮用水浓集物引起的p53基因外显子7DNA损伤，以及对N-ras、H-ras基因外显子1和2的损伤作用。但LMPCR和改进后建立的RDPCR均存在实验步骤多，必须在多步骤结束后才能根据最终的实验结果判断实验条件的优化是否成功，而优化的实验条件对实验本身的特异性至关重要。同时由于不同化学物的损伤性质和损伤热点是不同的，如若能将RDPCR检测DNA损伤定位于特定基因的核苷酸，则可为致癌物的致癌机理研究提出更为可靠的资料。本研究的目的是确定一种优化RDPCR条件的简易方法，并定位DNA损伤于核苷酸水平，通过应用该法对K-ras基因外显子1和2DNA损伤的研究，对多种环境致癌物的检测，探讨这些物质的分子致癌机制，为RDPCR的推广和应用积累更多的资料，同时也为环境致癌物的遗传毒性研究奠定一定的基础。本课题分为以下三部分：第一部分：短片段法优化RDPCR实验条件。常规培养TK6细胞，提取基因组DNA，扩增目的基因片段，制备K-ras基因外显子1和2的单链探针。扩增K-ras基因外显子1和2的目的产物片段（以下称短片段），纯化后，用限制性内切酶Hinfl酶切、构建损伤模型，经依赖随机化末端连接物PCR（RDPCR）扩增后与单链探针杂交显色。RDPCR每一步产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果确定每一步的最佳反应条件。将该反应条件应用于酶切基因组DNA，对其酶切位点进行检测，验证短片段法优化RDPCR实验条件用于检测基因组DNA损伤的可行性。结果：扩增的K-ras基因外显子2测序结果与GENE BANK中效应序列一致，琼脂糖凝胶电泳及与双链外显子1和2杂交结果证实探针制备成功。Southern杂交证实短片段法成功优化对K-ras基因外显子1和2的RDPCR检测条件。应用该实验条件检测限制性内切酶Hinfl酶切构建的K-ras基因外显子1和2DNA损伤，短片段和基因组DNA均在相对于对照的预期位置出现杂交条带。可见，短片段法优化RDPCR实验条件简单易行，又节约人力、物力和时间，适用于对基因组DNA损伤的检测。第二部分：RDPCR将DNA损伤定位于核苷酸水平方法的建立。以酶切K-ras基因外显子2 RDPCR产物为模板，作重复扩增，产物与杂交结果进行比较，纯化目的片段，克隆测序，以测序结果与GENE BANK中K-ras基因外显子2序列比对，来分析检测到的损伤位点。通过鉴定损伤位点是否与酶切位点一致，验证方法的正确性和可行性。测序结果表明损伤位于酶切位点。证实RDPCR结合测序技术，可将DNA损伤位点精确定位于单个核苷酸，有值得继续研究和推广应用的价值。第三部分：RDPCR检测环境致癌物的DNA损伤。DCB、Bap、MMS、SA、DCA、TCA、TNF和4NQO染毒TK6细胞，抽提基因组DNA，以染毒DNA为模板进行RDPCR。产物一部分用作Southern blot，一部分用嵌套引物扩增后纯化回收，克隆、测序。结果：RDPCR检测DCB对K-ras基因外显子2的DNA损伤中Southern blot在略滞后于对照位置出现杂交条带；测序结果显示损伤位点位于K-ras基因外显子2第65位G碱基（K-ras基因59位密码子第二位碱基G）。RDPCR检测BaPS9+／-对K-ras基因外显子2的DNA损伤中，BaPS9+RDPCR产物Southern blot，在略滞后于对照位置出现杂交条带；测序结果显示损伤位点位于K-ras基因外显子2第66位T碱基（K-ras基因59位密码子第三号碱基T）；BaPS9-未检测到对K-ras基因外显子2的DNA损伤。在RDPCR检测MMS对K-ras基因外显子2的DNA损伤中，Southernblot在滞后于对照位置出现杂交条带；测序结果显示损伤位点位于K-ras基因外显子2上游第13位碱基G（K-ras基因外显子2的上游内含子序列）。在RDPCR检测SA对K-ras基因外显子2的DNA损伤中，Southernblot在超前于对照位置出现杂交条带；测序结果显示损伤位点位于K-ras基因外显子2上第127位碱基T（K-ras基因80位密码子第三号碱基T）。在RDPCR检测DCA对K-ras基因外显子2的DNA损伤中，Southernblot在次低浓度下出现滞后于对照位置的单一杂交条带，低浓度下出现超前和滞后对照位置的两条杂交条带，滞后条带位置与次低浓度并不相同；未检测到TCA对K-ras基因外显子2的DNA损伤。在RDPCR检测TNF和4NQO对K-ras基因外显子2的DNA损伤中，Southern blot均在略滞后于对照位置出现一条杂交条带。由此可见，联苯胺等多种环境化学物均引起K-ras基因外显子2的DNA损伤，但测序结果证实损伤位点并不一致，可见化学物攻击靶点并不一致。但联苯胺和BaPS9+攻击靶点均位于K-ras基因外显子2第59密码子上，提示该密码子是化学物易受攻击的靶点之一。未检测到三氯乙酸对K-ras基因外显子2的损伤，提示其作用靶点可能不在K-ras基因外显子2上。