猪PR-39抗菌肽来源于猪嗜中性粒细胞等免疫细胞,是含有39个氨基酸残基的cathelicidin家族抗菌肽。目前的研究已发现PR-39可以从猪小肠组织和外周血嗜中性粒细胞中分离纯化得到,对常见病原微生物具有广谱抗菌活性,也具有趋化、抑制炎症、促进损伤修复等免疫功能。但是PR-39在动物,特别是仔猪肠道免疫中作用的研究较少。因此,本研究设计了三个试验,首先以抗病力不同的猪种——地方品种莱芜猪、荣昌猪、藏猪和原产丹麦的长白猪为模型,比较了猪PR-39抗菌肽基因和肠道先天免疫因子基因表达的品种差异,在此基础上,研究了PR-39基因的组织特异性和日龄表达规律；进一步利用金华猪和长白猪建立仔猪大肠杆菌K88攻毒模型,探讨了细菌攻毒对PR-39抗菌肽基因表达的调控及其与猪肠道结构和免疫功能的关系；最后通过体外巨噬细胞培养试验,研究了PR-39抗菌肽对猪巨噬细胞极化类型和免疫功能的影响,旨在初步阐明猪PR-39抗菌肽在仔猪肠道免疫中的作用。主要研究结果如下：试验一：猪PR-39抗菌肽基因的品种差异和表达规律针对抗病力不同的地方品种莱芜猪、荣昌猪和藏猪,以及原产丹麦的长白猪,首先比较了中国地方品种猪和长白猪PR-39抗菌肽和肠道先天免疫关键基因表达的品种差异。结果表明,地方品种猪PR-39基因表达量总体上高于长白猪,其中荣昌猪在骨髓、胸腺和十二指肠中PR-39基因的表达量显著高于长白猪(p<0.05),而藏猪在胸腺和肝脏中的表达量显著高于长白猪(p<0.05)。肠道先天免疫因子表达的品种差异结果表明,地方品种猪中,荣昌猪的肠道主要先天免疫因子表达水平总体高于长白猪；细胞因子方面,来莱芜猪和荣昌猪IL-1α和IL-1β表达量高于长白猪(p<0.05),而莱芜猪、藏猪IFN-y的表达量显著高于长白猪(p<0.05)；趋化因子方面,荣昌猪MCP-1和IL-8的表达量显著高于长白猪(p<0.05),而藏猪仅MCP-1的表达量显著高于长白猪；主要病原模式识别受体基因方面,地方品种猪TLR-2,4,5和NOD-1,2基因表达量总体高于长白猪,其中荣昌猪TLR-2,4,5以及NOD-1,2基因mRNA表达量显著高于长白猪(p<0.05)。上述试验结果说明,抗病力较高的地方品种猪PR-39抗菌肽与肠道先天免疫因子表达水平总体上高于长白猪,揭示猪PR-39抗菌肽及相关免疫因子的表达水平可能与不同品种猪的抗病免疫力存在一定的关系。进一步对PR-39基因组织特异性表达研究的结果表明,骨髓是猪PR-39抗菌肽基因表达的主要部位,脾脏、肝脏、肠系膜淋巴结和十二指肠等组织中的表达量较低。日龄表达规律结果显示,金华猪PR-39的表达量从出生到90日龄逐渐增加,90到120日龄降低；而长白猪则PR-39表达量从出生到60日龄逐渐增加,60到120日龄逐渐降低；总体上PR-39呈现随日龄先增加后降低的规律。试验二：大肠杆菌K88攻毒对仔猪肠道功能和PR-39抗菌肽基因表达的影响在初步探讨PR-39抗菌肽及相关免疫因子与猪抗病免疫力关系的基础上,本试验以金华猪和长白猪为研究对象,建立仔猪大肠杆菌K88攻毒模型,比较了攻毒对两品种猪生长性能、腹泻率、肠道主要微生物数量、小肠形态和免疫功能影响,进一步探讨了细菌攻毒对PR-39抗菌肽基因的表达的影响及其与肠道免疫功能的关系。生长性能和腹泻率的结果表明：日增重方面；与对照组金华猪相比,攻毒使金华猪的日增重降低了32.1%(p<0.05)；与对照组长白猪相比,攻毒使长白猪的日增重降低了28.6%,攻毒使金华猪日增重降低的趋势低于长白猪。料重比方面,与各自的对照组相比,攻毒组的金华猪和长白猪料重比都有增加的趋势,但差异不显著；攻毒组金华猪的料重比有低于攻毒组长白猪的趋势,但差异不显著。腹泻率方面,对照组的金华猪与长白猪之间腹泻率无显著差异；与对照组金华猪相比,攻毒组金华猪腹泻率有增加的趋势；与对照组长白猪(2.4%)相比,攻毒组长白猪的腹泻率(26.2%)显著增加(p<0.05)；但是攻毒组金华猪的腹泻率(7.1%)显著低于攻毒组长白猪(26.2%)(p<0.05)；攻毒使金华猪腹泻率增加的程度显著地低于长白猪(p<0.05)。肠道主要微生物数量的结果表明：大肠杆菌数量及其占总菌比例方面,对照组金华猪结肠大肠杆菌数量显著低于对照组长白猪(p<0.05),大肠杆菌占总菌的比例也有低于长白猪的趋势；与对照组金华猪相比,攻毒组金华猪结肠大肠杆菌数量显著增加(p<0.05),大肠杆菌占总菌的比例有增加的趋势；与对照组长白猪相比,攻毒组长白猪结肠大肠杆菌数量及其占总菌比例均显著增加(p<0.05)；攻毒组金华猪大肠杆菌的数量及其占总菌的比例都显著地低于攻毒组长白猪(p<0.05)；攻毒使金华猪大肠杆菌的数量及比例增加的趋势要低于长白猪。乳酸杆菌数量及其占总菌比例方面,对照组金华猪结肠乳酸杆菌及其占总菌的比例与对照组长白猪无显著差别；与对照组金华猪相比,攻毒组金华猪结肠乳酸杆菌数量及其比例无显著变化；而与对照组长白猪相比,攻毒组长白猪结肠乳酸杆菌数量显著降低(p<0.05),乳酸杆菌占总菌的比例有降低的趋势；攻毒组金华猪结肠乳酸杆菌的数量及其占总菌的比例有高于攻毒组长白猪的趋势,并且攻毒对金华猪乳酸杆菌数量降低的程度显著低于长白猪(p<0.05)。乳酸杆菌/大肠杆菌的比值方面,对照组金华猪乳酸杆菌/大肠杆菌比值显著地高于长白猪(p<0.05)；与各自的对照组相比,攻毒组的金华猪和长白猪乳酸杆菌/大肠杆菌比值都显著地降低(p<0.05)；虽然攻毒对金华猪乳酸杆菌/大肠杆菌比值降低的趋势要显著地高于长白猪(p<0.05),但是攻毒组金华猪该比值仍然有高于攻毒组长白猪的趋势。小肠形态结构与紧密连接蛋白基因表达的结果表明：小肠形态结构方面,大肠杆菌K88攻毒对金华猪和长白猪小肠的正常形态结构均造成了破坏；各肠段中,攻毒对回肠的影响最明显——与对照组金华猪相比,攻毒组金华猪回肠绒毛高度和绒毛/隐窝比值都显著降低(p<0.05)；长白猪也观察到类似的结果,与对照组长白猪相比,攻毒组长白猪回肠绒毛高度和绒毛/隐窝比值也都显著降低(p<0.05)；攻毒组金华猪小肠绒毛高度与绒毛/隐窝比值有高于攻毒组长白猪的趋势。肠道紧密连接蛋白基因表达水平方面,与各自的对照组相比,攻毒组的金华猪和长白猪十二指肠、空肠、回肠中紧密连接蛋白claudin-1、 occludin、 ZO-1和ZO-2基因的表达水平总体上都明显降低。各肠段中,攻毒对仔猪空肠紧密连接蛋白基因变化的影响最明显——与对照组金华猪相比,攻毒组金华猪空肠occludin、 ZO-1和ZO-2表达水平显著降低(p<0.05),claudin-1表达有降低的趋势；与对照组长白猪相比,攻毒组长白猪空肠occludin表达水平显著降低(p<0.05),claudin-1、 ZO-1和ZO-2表达有降低的趋势；攻毒组金华猪occludin表达水平显著高于攻毒组长白猪(p<0.05), claudin-1、ZO-1和ZO-2有高于长白猪的趋势。虽然攻毒使金华猪紧密连接蛋白水平降低的程度要高于长白猪,但是金华猪无论是对照组或是攻毒组,紧密连接蛋白的表达水平总体上都高于长白猪。免疫球蛋白和肠道免疫因子的结果表明：免疫球蛋白水平方面,对照组金华猪与对照组长白猪相比,免疫球蛋白IgA和IgG水平均无显著差异；与对照组金华猪相比,攻毒组金华猪血清IgA和IgG的水平显著增加(p<0.05),；与对照组长白猪相比,攻毒组长白猪血清IgA和IgG有增加的趋势；攻毒组金华猪的IgG水平显著高于攻毒组长白猪(p<0.05),而IgA水平与攻毒组长白猪相比无显著差异,提示金华猪具有较强的抗体生成能力。肠道sIgA方面,对照组金华猪与对照组长白猪相比,回肠sIgA水平无显著差异；与各自的对照组相比,攻毒组的金华猪和长白猪回肠sIgA水平都显著增加(p<0.05),提示攻毒一定程度上激活了肠道粘膜免疫；攻毒组金华猪sIgA有高于攻毒组长白猪的趋势。肠道细胞因子方面,对照组金华猪回肠中促炎性细胞因子IFN-γ、 TNF-α IL-6和抗炎细胞因子TGF-β的水平显著高于对照组长白猪(p<0.05),而抗炎细胞因子IL-4水平显著低于长白猪(p<0.05)；与对照组金华猪相比,攻毒组金华猪促炎性细胞因子IFN-y. TNF-a和IL-6水平显著增加(p<0.05),而抗炎细胞因子TGF-β和IL-4水平显著降低(p<0.05)；与对照组长白猪相比,攻毒组长白猪促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α水平显著增加(p<0.05),IL-6水平有增加的趋势,抗炎细胞因子TGF-β和IL-4水平显著降低(p<0.05)；攻毒对金华猪TNF-a增加的趋势以及对IL-4降低的趋势均显著地低于长白猪(p<0.05),提示与攻毒组长白猪相比,攻毒组金华猪的肠道炎症反应程度较轻。在比较了大肠杆菌K88攻毒对金华猪和长白猪生长性能、腹泻率、肠道主要微生物数量、小肠形态和肠道免疫等功能影响的基础上,对不同组织中PR-39抗菌肽基因表达水平检测结果表明：在骨髓、脾脏、胸腺、肝脏、肺和回肠组织中,对照组金华猪PR-39抗菌肽基因表达水平有高于对照组长白猪的趋势,在肠系膜淋巴结中,对照组金华猪PR-39表达水平显著高于长白猪(p<0.05)；与对照组金华猪相比,攻毒组金华猪PR-39基因在骨髓、脾脏和回肠中的表达水平显著增加(p<0.05)；而攻毒组长白猪与对照组相比,在骨髓、脾脏和回肠中的表达水平有增加的趋势；攻毒组金华猪在骨髓、脾脏、肠系膜淋巴结和回肠组织中PR-39的表达水平显著高于攻毒组长白猪(p<0.05),并且攻毒对金华猪骨髓和脾脏PR-39表达水平增加的趋势显著高于长白猪(p<0.05)。本试验结果表明,与长白猪相比,金华猪为大肠杆菌K88受体抵抗基因型,攻毒对其日增重降低的趋势、腹泻率增加的趋势、结肠大肠杆菌增加和乳酸杆菌减少的趋势影响较小,同时金华猪在攻毒后维持了较好的小肠形态与较高的紧密连接蛋白基因表达水平,肠道炎症反应的程度显著低于长白猪；上述表现可能与金华猪攻毒后PR-39抗菌肽被诱导增加的程度,以及PR-39的表达水平显著高于长白猪有关。本试验结果初步揭示,猪内源性抗菌肽PR-39能够受到大肠杆菌K88攻毒的诱导表达,并可能参与了对仔猪肠道微生物、屏障和黏膜免疫等多种肠道功能的调节。试验三：猪PR-39抗菌肽对巨噬细胞极化类型和免疫功能的影响在初步阐明PR-39抗菌肽与猪肠道免疫功能关系的基础上,本试验以猪巨噬细胞3D4/2为体外研究对象,探讨了猪PR-39抗菌肽对大肠杆菌感染猪巨噬细胞的影响,并进一步研究了PR-39对猪巨噬细胞极化类型和免疫功能的影响。PR-39对大肠杆菌感染猪巨噬细胞影响的试验结果表明,细菌感染破坏了猪巨噬细胞的正常形态结构,显著增加了巨噬细胞LDH释放率,并显著增加了促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8以及环氧合酶COX-2的表达(p<0.05)；而加入抗菌肽PR-39能够明显缓解感染引起的LDH释放和上述炎症介质的表达。PR-39对猪巨噬细胞极化类型影响的试验中,利用IFN-y诱导巨噬细胞的M1型极化,M-CSF和IL-4诱导巨噬细胞的M2型极化。试验结果表明,PR-39协同诱导M1型(主要发挥吞噬、清除病原和凋亡细胞的作用)巨噬细胞极化时,与M1型巨噬细胞相比,显著提高了M1型标识基因IL-12p40、TNF-α、IL-6,以及M1型极化关键信号分子STAT-1基因的表达(p<0.05),表明PR-39促进了猪巨噬细胞向M1型极化；PR-39协同诱导M2型(主要发挥组织修复和免疫调节的作用)巨噬细胞极化时,与M2型巨噬细胞相比,显著降低了M2型标识基因IL-10和TGF-β基因的表达(p<0.05),却增加了M1型标识基因IL-12p40和COX-2的表达(p<0.05),表明PR-39一定程度上抑制了猪巨噬细胞的M2型极化,并促进M2型向M1型转化。PR-39协同诱导对猪巨噬细胞免疫功能影响的结果表明：PR-39协同诱导首先显著促进了猪巨噬细胞的吞噬功能；与空白对照组相比,PR-39组猪巨噬细胞的吞噬率显著增加(p<0.05)；与M1型巨噬细胞相比,PR-39协同诱导M1型的吞噬率显著增加(p<0.05),说明PR-39显著促进了M1型猪巨噬细胞的吞噬功能；与空白对照和M1型巨噬细胞相比,M2型巨噬细胞的吞噬率显著低于上述两组(p<0.05),提示M2型巨噬细胞吞噬功能较弱；而与M2型巨噬细胞相比,PR-39协同诱导M2型巨噬细胞的吞噬率显著提高(p<0.05),说明PR-39具有增强M2型巨噬细胞吞噬功能的作用。PR-39对大肠杆菌粘附与入侵巨噬细胞的影响结果表明,添加PR-39协同诱导显著抑制了大肠杆菌对猪巨噬细胞的粘附与入侵；与空白对照组相比,PR-39单独处理显著降低了粘附与入侵猪巨噬细胞的细菌数量(p<0.05)；M1型和PR-39协同诱导M1型巨噬细胞的细菌数量均显著低于空白对照组(p<0.05),说明M1型和PR-39协同诱导M1型巨噬细胞均具有抑制大肠杆菌粘附与入侵的作用。M2型巨噬细胞的细菌数量与对照组相比无显著差异,而添加PR-39协同诱导M2型巨噬细胞的细菌数量显著低于对照组和M2型(p<0.05),说明M2型巨噬细胞基本不抑制细菌的粘附与入侵,而PR-39显著增强了M2型巨噬细胞抑制细菌粘附与入侵的能力。上述试验结果揭示,PR-39抗菌肽能够缓解大肠杆菌感染引起的猪巨噬细胞的炎症反应和细胞损伤,并可通过协同诱导促进巨噬细胞向M1型极化,增强了猪巨噬细胞的吞噬功能,抑制了细菌对巨噬细胞的粘附与入侵。综上所述,通过以上三个试验,揭示了猪PR-39抗菌肽及相关免疫因子的表达水平可能与不同品种猪的抗病免疫力有关,并通过仔猪大肠杆菌攻毒试验,证明了金华猪对大肠杆菌K88攻毒具有较强的耐受性,可能与金华猪攻毒后较高的PR-39表达水平密切相关,进一步利用体外巨噬细胞培养模型,揭示了PR-39可通过协同诱导促进巨噬细胞向M1型极化的机制,增强了猪巨噬细胞的吞噬功能,并抑制细菌的粘附与入侵。