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芋螺是一种生活在热带海洋浅水区的软体动物,其毒液管分泌的芋螺毒素
是芋螺捕食的主要武器。芋螺毒素是一类富含二硫键(也有少数不含二硫键)
的活性多肽,多数由10-40个氨基酸组成,能特异地作用于各种离子通道和神
经递质受体。根据信号肽序列和半胱氨酸骨架的不同,芋螺毒素可以被分为七
个主要的超家族:A-,T-,O-,M-,P-,I-和S-超家族,最近还发现了L-和J-超家族。
相对于其它动物毒素,芋螺毒素具有分子量小、结构稳定、序列超变异、作用
靶点广泛、功能专一、组织特异性强等优点,既可以被用作神经生物学研究的
探针,也可被直接开发成药物或作为药物的先导化和物。因此对芋螺毒素的研
究有重要的理论意义和实际意义。
本文第一部分是研究α-芋螺毒素的基因结构。从五种芋螺,包括食鱼的花
玛瑙芋螺(C .achatinus),食软体动物的大理石芋螺(C. marmoreus),食虫的
槲芋螺(C. quecrinus)、豹芋螺(C. leopardus)和芝麻芋螺(C. pulicarius)中,
克隆得到8个α-芋螺毒素的基因序列(包括两个假基因)。结果表明α-芋螺毒素
的基因为两个外显子中间插入一个内含子的结构,内含子插入于前体肽第六个
氨基酸的密码子中,且第二个外显子的编码区(编码前体肽的后一部分和成熟
肽)的突变速率比第一个外显子(编码信号肽和前体肽的前一部分)高得多。
对内含子序列的分析表明,与其它动物毒素相比,α-芋螺毒素的内含子更长,
序列更复杂,有两种特殊的重复序列,此外3’端的最后14个核苷酸完全一致。
芋螺毒素的内含子结构很可能与成熟肽的高突变率有关。同时,利用保守的内
含子3’端序列,还从基因组DNA中克隆到了更多的α-芋螺毒素,这是除了蛋
白分离纯化和从cDNA克隆以外的第三种得到芋螺毒素序列的方法。
本文第二部分是对唐草芋螺(C. caracteristicus)的芋螺毒素进行了蛋白分
离纯化和cDNA克隆。唐草芋螺是中国南海的一种食虫芋螺。本文的研究表明,
它的毒液中富含A-,O-、M-、T-超家族芋螺毒素及与I-超家族相似的含有四对
二硫键的芋螺毒素。其中分离纯化到的α-芋螺毒素CaIA和CaIB含有γ-羧基谷
氨酸,它们的cDNA克隆和前体肽序列丰富了对γ-羧基化酶识别位点的理解,
并测定了它们对部分乙酰胆碱受体亚型的活性。另外分离纯化到的calla和
callb具有与I-超家族相似的半胱氨酸骨架,但是cDNA克隆的结果表明它们
的信号肽序列不同。利用这段信号肽序列从芝麻(C. pulicarius)及信号芋螺
(C. litteratus)中也克隆得到类似于calla的序列及含有6个半胱氨酸的毒素。
因此这种毒素是广泛存在的,可能是I-超家族的一个新家族。本文还分离纯化
到一个含有四对二硫键的ca3517,其半胱氨酸骨架和目前已发现的芋螺毒素都
不一样。最后本文尝试了用酿酒酵母重组表达calla。
关键词:芋螺毒素,基因结构,内含子,分离纯化,cDNA克隆