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目的：
1.明确SLE患者CD4+T细胞mRNA甲基化修饰特征
2.分析SLE患者CD4+T细胞m5C修饰基因的特征
3.阐述SLE患者CD4+T细胞m5C修饰与基因功能的关联
方法：
1.通过RT-qPCR检测22例SLE患者和23例健康人外周血CD4+T细胞中4种甲基化修饰酶（METTL3、FTO、NSUN2和ALYREF）的表达量。对20例SLE患者（SA1、SA2、SM-MA1、SM-MA2）和18例健康人（HC1、HC2）外周血CD4+T细胞进行基于LC-MS mRNA的修饰检测，明确SLE患者CD4+T细胞mRNA中确实存在甲基化修饰异常。
2.对20例SLE患者（SA1、SA2、SM-MA1、SM-MA2）和18例健康人（HC1、HC2）外周血CD4+T细胞进行mRNA重亚硫酸氢盐测序（mRNA-m5C-BisSeq）,获得SLE患者CD4+T细胞mRNA中存在的m5C位点，并对m5C位点的数量及甲基化水平进行分析，确定SLE患者CD4+T细胞mRNA转录物中m5C位点的富集特征。
3.对20例SLE患者（SA1、SA2、SM-MA1、SM-MA2）和18例健康人（HC1、HC2）外周血CD4+T细胞进行mRNA-m5C-BisSeq和mRNA-Seq。获得SLE患者CD4+T细胞mRNA差异m5C甲基化基因和mRNA本身的差异基因，进一步分析其功能变化，探索基因存在m5C甲基化是否会影响基因本身的表达。除此之外，通过Reactome Pathways分析NSUN2靶基因低甲基化基因功能，并根据以上实验及分析结果描绘了SLE患者CD4+T细胞mRNA m5C甲基化的功能示意图。探讨SLE患者CD4+T细胞中m5C的表达失调以及这些mRNA在SLE发病机理中的潜在功能。
结果：
1．RT-qPCR检测结果显示甲基化相关修饰酶METTL3、FTO、NSUN2和ALYREF在SLE患者外周血CD4+T细胞中较健康人mRNA表达水平明显降低。LC-MS检测在SLE患者和健康人CD4+T细胞中测到了11种mRNA甲基化修饰。其中mRNA的m3C、m1G和m5C的修饰率随着SLE疾病活动度的增加而明显减少。
2.在健康人CD4+T细胞mRNA上检测到2436个m5C位点，在活动度为SA的SLE患者CD4+T细胞mRNA上检测到297个m5C位点,在活动度为SM-MA的SLE患者CD4+T细胞mRNA上检测到233个m5C位点,并且mRNA m5C位点甲基化水平随着SLE疾病活动度的增加而明显降低。除此之外，发生甲基化的基因数量随着SLE疾病活动度的增加而增加，而m5C位点数量却随着SLE疾病活动度的增加而减少。在SLE患者CD4+T细胞中以一个基因只有1个甲基化位点为主。随着SLE疾病活动度的增加，mRNA m5C位点在CHH区的占比减少，而在CHG区和CG区的占比增加。m5C位点不仅分布在3UTR内Argonaute蛋白质的结合区附近，更多的富集在翻译起始位点下游的区域和CDS起始区域中。
3.与健康人（HC）比较，SLE稳定期患者（SA）的CD4+T细胞中发现了78个m5C低甲基化基因和131个m5C超甲基化基因,SLE患者（SM-MA）的CD4+T细胞中发现了80个低甲基化基因，166个超甲基化基因。SLE患者（SA、SM-MA）m5C超甲基化基因均富含免疫相关途径，包括细胞因子介导的信号传导途径和免疫细胞的稳态。在这些MCODE中，SLE患者（SA、SM-MA）PPI网络中主要途径是mRNA剪接。SLE患者（SA、SM-MA）m5C低甲基化基因在真核翻译延伸，蛋白质甲基化等方面均显着富集,差异基因均与机体系统中的炎症和免疫相关途径（趋化因子信号传导，Toll样受体信号传导，IL-17信号通路等），人类疾病（类风湿关节炎和SLE等）和环境信息处理（细胞因子-细胞因子受体相互作用，TNF信号通路等）相关。Reactome Pathways分析显示，这15个NSUN2表达下调的靶向低甲基化基因富含代表性的转录相关途径，包括真核翻译延伸和终止，肽链延伸，mRNA翻译和代谢等。
结论：
1.RT-qPCR和LC-MS检测结果显示SLE患者CD4+T细胞mRNA中确实存在m5C修饰异常。
2.SLE患者CD4+T细胞mRNA中的m5C位点数量及m5C位点水平较健康人低。在健康人CD4+T细胞中存在少数基因高甲基化现象，在SLE患者CD4+T细胞中存在多数基因低甲基化现象。m5C位点不仅分布在3UTR内Argonaute蛋白质的结合区附近，更多的富集在翻译起始位点下游的区域和CDS起始区域中。SLE患者CD4+T细胞中m5C位点偏好嵌入富含CG的环境中。
3.mRNA m5C修饰调节SLE患者CD4+T细胞多种功能。m5C低甲基化和超甲基化的基因参与细胞功能与通路不同。SLE患者CD4+T细胞中m5C低甲基化基因影响了蛋白翻译，而m5C超甲基化基因可能影响细胞因子介导的信号通路，mRNA剪接、稳定和翻译等，这些机制共同参与SLE的发生发展。
1.明确SLE患者CD4+T细胞mRNA甲基化修饰特征
2.分析SLE患者CD4+T细胞m5C修饰基因的特征
3.阐述SLE患者CD4+T细胞m5C修饰与基因功能的关联
方法：
1.通过RT-qPCR检测22例SLE患者和23例健康人外周血CD4+T细胞中4种甲基化修饰酶（METTL3、FTO、NSUN2和ALYREF）的表达量。对20例SLE患者（SA1、SA2、SM-MA1、SM-MA2）和18例健康人（HC1、HC2）外周血CD4+T细胞进行基于LC-MS mRNA的修饰检测，明确SLE患者CD4+T细胞mRNA中确实存在甲基化修饰异常。
2.对20例SLE患者（SA1、SA2、SM-MA1、SM-MA2）和18例健康人（HC1、HC2）外周血CD4+T细胞进行mRNA重亚硫酸氢盐测序（mRNA-m5C-BisSeq）,获得SLE患者CD4+T细胞mRNA中存在的m5C位点，并对m5C位点的数量及甲基化水平进行分析，确定SLE患者CD4+T细胞mRNA转录物中m5C位点的富集特征。
3.对20例SLE患者（SA1、SA2、SM-MA1、SM-MA2）和18例健康人（HC1、HC2）外周血CD4+T细胞进行mRNA-m5C-BisSeq和mRNA-Seq。获得SLE患者CD4+T细胞mRNA差异m5C甲基化基因和mRNA本身的差异基因，进一步分析其功能变化，探索基因存在m5C甲基化是否会影响基因本身的表达。除此之外，通过Reactome Pathways分析NSUN2靶基因低甲基化基因功能，并根据以上实验及分析结果描绘了SLE患者CD4+T细胞mRNA m5C甲基化的功能示意图。探讨SLE患者CD4+T细胞中m5C的表达失调以及这些mRNA在SLE发病机理中的潜在功能。
结果：
1．RT-qPCR检测结果显示甲基化相关修饰酶METTL3、FTO、NSUN2和ALYREF在SLE患者外周血CD4+T细胞中较健康人mRNA表达水平明显降低。LC-MS检测在SLE患者和健康人CD4+T细胞中测到了11种mRNA甲基化修饰。其中mRNA的m3C、m1G和m5C的修饰率随着SLE疾病活动度的增加而明显减少。
2.在健康人CD4+T细胞mRNA上检测到2436个m5C位点，在活动度为SA的SLE患者CD4+T细胞mRNA上检测到297个m5C位点,在活动度为SM-MA的SLE患者CD4+T细胞mRNA上检测到233个m5C位点,并且mRNA m5C位点甲基化水平随着SLE疾病活动度的增加而明显降低。除此之外，发生甲基化的基因数量随着SLE疾病活动度的增加而增加，而m5C位点数量却随着SLE疾病活动度的增加而减少。在SLE患者CD4+T细胞中以一个基因只有1个甲基化位点为主。随着SLE疾病活动度的增加，mRNA m5C位点在CHH区的占比减少，而在CHG区和CG区的占比增加。m5C位点不仅分布在3UTR内Argonaute蛋白质的结合区附近，更多的富集在翻译起始位点下游的区域和CDS起始区域中。
3.与健康人（HC）比较，SLE稳定期患者（SA）的CD4+T细胞中发现了78个m5C低甲基化基因和131个m5C超甲基化基因,SLE患者（SM-MA）的CD4+T细胞中发现了80个低甲基化基因，166个超甲基化基因。SLE患者（SA、SM-MA）m5C超甲基化基因均富含免疫相关途径，包括细胞因子介导的信号传导途径和免疫细胞的稳态。在这些MCODE中，SLE患者（SA、SM-MA）PPI网络中主要途径是mRNA剪接。SLE患者（SA、SM-MA）m5C低甲基化基因在真核翻译延伸，蛋白质甲基化等方面均显着富集,差异基因均与机体系统中的炎症和免疫相关途径（趋化因子信号传导，Toll样受体信号传导，IL-17信号通路等），人类疾病（类风湿关节炎和SLE等）和环境信息处理（细胞因子-细胞因子受体相互作用，TNF信号通路等）相关。Reactome Pathways分析显示，这15个NSUN2表达下调的靶向低甲基化基因富含代表性的转录相关途径，包括真核翻译延伸和终止，肽链延伸，mRNA翻译和代谢等。
结论：
1.RT-qPCR和LC-MS检测结果显示SLE患者CD4+T细胞mRNA中确实存在m5C修饰异常。
2.SLE患者CD4+T细胞mRNA中的m5C位点数量及m5C位点水平较健康人低。在健康人CD4+T细胞中存在少数基因高甲基化现象，在SLE患者CD4+T细胞中存在多数基因低甲基化现象。m5C位点不仅分布在3UTR内Argonaute蛋白质的结合区附近，更多的富集在翻译起始位点下游的区域和CDS起始区域中。SLE患者CD4+T细胞中m5C位点偏好嵌入富含CG的环境中。
3.mRNA m5C修饰调节SLE患者CD4+T细胞多种功能。m5C低甲基化和超甲基化的基因参与细胞功能与通路不同。SLE患者CD4+T细胞中m5C低甲基化基因影响了蛋白翻译，而m5C超甲基化基因可能影响细胞因子介导的信号通路，mRNA剪接、稳定和翻译等，这些机制共同参与SLE的发生发展。