随着社会的发展和生活水平的提高，我国人民的生活方式发生了较大的变化，慢性非传染性疾病逐渐上升成为我国居民主要的死亡原因。近年来的研究发现许多慢性非传染性疾病的发生、发展均与炎症有着密切的关系。因此，降低机体炎症反应水平是慢病预防和控制的重要一环。　　 炎症的实质是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的一种防御性反应，外源性和内源性损伤因子均可引起机体细胞和组织各种各样的损伤性变化。与此同时，机体的局部和全身也调动一系列免疫细胞及免疫因子，以局限和消灭损伤因子，清除和吸收坏死细胞，并通过实质和间质细胞的再生修复损伤。这种机体的损伤和对损伤的复杂反应构成了炎症现象。以血管系统改变为中心的一系列局部反应，有利于清除或消灭致病因子，如：液体的渗出可稀释毒素；吞噬搬运坏死组织以利于再生和修复；使致病因子局限在炎症部位而不致蔓延全身。因此，炎症作为机体的防御性反应，通常对机体是有利的。但是炎症对机体也有危害性，炎症并不是某种疾病的特异反应，它可能影响整个机体，而不仅仅是机体的某个部位，炎性因子可能导致一些看起来并不相关的疾病或症状的发生，如动脉粥样硬化、中风、糖尿病、肿瘤等。所以，在某些情况下，采取措施来控制机体的炎症反应有利于预防慢性非传染性疾病的发生和发展。本文受到国家自然科学基金资助(项目号：30872101)。　　 叶酸是含有蝶酰谷氨酸结构的一类化合物的统称，因最初从菠菜叶中分离而得名。天然叶酸在深绿色的叶类蔬菜、橙汁、芦笋、草莓、花生和豆类食物中含量丰富。叶酸是体内重要生化反应中－碳单位的运载体，它不仅可以通过腺嘌呤、胸苷酸影响DNA和RNA的合成，而且还可以通过蛋氨酸代谢影响磷脂、肌酸、神经介质以及血红蛋白的合成。自叶酸发现以来，被认为与许多疾病有关，如神经管畸形、一些退行性疾病、肿瘤、心脑血管疾病等。近年来，一些研究发现，叶酸在预防或治疗某些与炎症相关的疾病中具有一定疗效。国内研究也发现叶酸在治疗腹泻、炎症性肠病、慢性萎缩性胃炎、肺癌癌前病变等方面有较好效果。　　 血浆高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)被认为是心、脑血管和外周血管动脉粥样硬化性疾病及静脉血栓形成的独立危险因素，可经补充叶酸、维生素B12，维生素B6而纠正。大多数的研究认为：叶酸通过参与蛋氨酸代谢，来降低血浆同型半胱氨酸浓度，从而起到抗动脉粥样硬化的作用。然而近年的研究发现：叶酸的抗动脉粥样硬化作用可能并不完全是通过降低血浆Hcy而实现的，而是与其抗炎作用有关。　　 叶酸在辅助治疗一些与炎症反应密切相关的疾病中有一定疗效，并且可以减轻局部炎症反应或者降低体内某些炎性因子的分泌，这些研究结果均提示叶酸可能具有抗炎作用。但叶酸的这种作用尚未被完全证实，机制也不明确。　　 炎症作为机体的防御性反应，与大多数慢性疾病有关。因此，降低炎症反应在疾病的预防和控制中是很关键的一环，加强食物中抗炎物质的研究对于慢性病的预防有着深远意义。叶酸是否具有抗炎作用，其抗炎作用是通过何种信号调节机制?深入研究这一问题，将为指导叶酸的合理应用提供更可靠的依据。　　 研究目的：　　 1.明确叶酸对炎性细胞模型炎性介质分泌的影响。　　 2.进一步探讨其抗炎作用的分子生物学机制。　　 研究方法：　　 1.建立炎症细胞模型。　　 RAW264.7细胞使用DMEM培养基，加入10％胎牛血清、终浓度为100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素，置于37℃，5％CO2环境的培养箱中培养。在细胞处于对数生长期时，用不同浓度LPS进行诱导，分别用ELISA法和硝酸还原酶法测定细胞分泌的NO、TNF-α、IL-1β与IL-6的量。确定LPS刺激的最佳作用剂量。　　 2.叶酸对细胞毒性的测定。　　 将处于对数生长期的细胞接种于96孔板(1×104/孔)，加入共0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL共7个干预梯度，置于37℃，5％CO2环境的培养箱中培养24小时。弃去上清液，用PBS洗涤3次后，每孔加入80μL新鲜DMEM培养液以及20μLMTT(5mg/mL)，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养4小时。终止培养，吸去上清后每孔加入150μLDMSO，摇床低速震荡10分钟，使用酶标仪检测490nm处每孔的吸光值，以判定不同浓度的叶酸对细胞的毒性影响。　　 3.测定叶酸干预后LPS诱导的RAW264.7细胞产生NO的水平。　　 将处于对数生长期的细胞接种于6孔板(1×105/孔)，实验组用不同浓度的叶酸预处理2h，加入LPS处理；阳性对照组不使用叶酸进行预处理，加同样剂量的LPS进行刺激；阴性对照组既不使用叶酸处理，也不添加LPS。在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h，收集上清。用硝酸还原酶法测定RAW264.7细胞产生的NO。　　 4.分别用RT-PCR和Western blot检测iNOS的mRNA表达和蛋白表达。　　 将处于对数生长期的细胞接种于6孔板(1×105/孔)，实验组用不同浓度的叶酸预处理2h，加入LPS处理；阳性对照组不使用叶酸进行预处理，加同样剂量的LPS进行刺激；阴性对照组既不使用叶酸处理，也不添加LPS。在37℃，5％CO2的培养箱中培养2h，收集细胞。使用Trizol试剂提取总RNA，利用RT-PCR技术检测iNOS的mRNA表达。收集细胞总蛋白，Western blot技术测定iNOS的蛋白表达。　　 5.测定叶酸干预后LPS诱导的RAW264.7细胞产生TNF-α、IL-1β以及IL-6的水平。　　 将处于对数生长期的细胞接种于6孔板(1×105/孔)，实验组用不同浓度的叶酸预处理2h，加入LPS处理；阳性对照组不使用叶酸进行预处理，加同样剂量的LPS进行刺激；阴性对照组既不使用叶酸处理，也不添加LPS。在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h，收集上清。用ELISA试剂盒检测RAW264.7细胞产生的TNF-α、IL-1β以及IL-6。　　 6.用RT-PCR检测TNF-α、IL-1β以及IL-6的mRNA表达。　　 将处于对数生长期的细胞接种于6孔板(1×105/孔)，实验组用不同浓度的叶酸预处理2h，加入LPS处理；阳性对照组不使用叶酸进行预处理，加同样剂量的LPS进行刺激；阴性对照组既不使用叶酸处理，也不添加LPS。在37℃，5％CO2的培养箱中培养2h，收集细胞。使用Trizol试剂提取总RNA，利用RT-PCR技术分别检测TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达。　　 7.Western blot测定MAPKs与NF-κB p65蛋白表达，探讨叶酸的抗炎机制。　　 将处于对数生长期的细胞接种于6孔板(1×105/孔)，实验组用不同浓度的叶酸预处理2h，加入LPS处理；阳性对照组不使用叶酸进行预处理，加同样剂量的LPS进行刺激；阴性对照组既不使用叶酸处理，也不添加LPS。在37℃，5％CO2的培养箱中培养30min，收集细胞总蛋白。使用Westernblot技术测定磷酸化水平的p38 MAPK、ERK1/2、SPAK/JNK以及NF-κB p65的蛋白表达，探讨叶酸的抗炎作用机制。　　 8.数据分析。　　 所有实验均重复三次以上，分别进行检测。采用SPSS13.0建立数据库，进行统计分析。结果以X±SD表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，各组间两两比较采用Bonferrni法。检验水准为0.05。　　 结论:　　 1.叶酸能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS、TNF-α、IL-1β的基因表达；降低LPS诱导的RAW264.7细胞NO、TNF-α以及IL-1β的分泌。因此，叶酸在RAW264.7细胞中具有抑制炎性介质产生的作用。　　 2.叶酸能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中磷酸化的MAPKs与NF-κB p65的蛋白表达，表明叶酸可能通过抑制MAPKs的磷酸化并阻断NF-κB通路的方式来下调LPS诱导的RAW264.7细胞中炎性介质的产生。