【研究背景及目的】肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）约占原发性肝癌的70-90%,具有起病隐匿、发展迅速、预后差、转移率高等特点。近年来其治疗虽然有了进展,但预后仍不令人满意。因而,许多研究者开始着眼于干预HCC的发生。但是,HCC早期发生的分子机制仍是未知,探索肿瘤起始机制对于发展早期发现手段和有效治疗措施至关重要。性别决定区Y框蛋白9（sex-determining region Y box protein 9,SOX9）是SOX家族中重要的转录因子,其在胚胎发育,维持细胞干性及组织稳态中具有重要意义,并在某些组织中被认为是干细胞的标志物。生理条件下,SOX9在肝脏中主要表达于胆管细胞,仅极少量表达于成熟肝细胞中。然而,在慢性肝损伤再生过程中,表达SOX9的肝细胞明显增多,这些SOX9阳性细胞表现为兼性肝干细胞,参与肝细胞和胆管细胞的再生。既往较多研究发现SOX9是一种促癌因子,在多种恶性肿瘤中都异常高表达,并与前列腺癌、胰腺癌和皮肤基底细胞癌的发生密切相关。SOX9在肝癌组织中亦高表达,且与不良预后相关。目前研究表明皮肤、血液、胃肠等多种器官或组织的恶性肿瘤可来源于各自的组织干细胞,且已有学者证实肝细胞癌起源于成熟肝细胞。因此,SOX9阳性兼性肝干细胞是否参与肝癌发生以及SOX9基因在肝癌起始阶段的作用有待明确。因此,基于以上研究背景,本课题即着重于研究表达SOX9的肝细胞和SOX9基因在肝细胞癌发生中的作用,并进一步探究其机制。【实验方法】一、小鼠原发性肝细胞癌模型诱导为明确SOX9对肝癌发生的影响,本研究共使用三种方法诱导小鼠发生原发性肝细胞癌,并选择不同时间点处死小鼠。1、STZ-HFD肝癌模型小鼠于出生后第2天,经皮下注射链脲佐菌素（streptozocin,STZ）（200ug/只）,于第四周起开始高脂饮食（high fat diet,HFD）,野生型小鼠约在高脂喂养12周时开始出现肝癌。2、DEN×1次肝癌模型小鼠于出生后第14天,经腹腔注射二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine,DEN）（25mg/Kg）,8-9月后,野生型小鼠发生肝癌。3、DEN×25次肝癌模型小鼠于出生后第5周起开始经腹腔注射DEN（35mg/Kg）,每周注射一次,野生型小鼠DEN注射约21次（小鼠约26周龄）发生原发性肝癌。二、探究小鼠原发性肝癌是否来自表达过SOX9的肝细胞1、Sox9-Flp/Ai65D小鼠的构建利用基因打靶技术,将IRES-Flp-poly A基因敲入到SOX9第3外显子后的终止序列和UTR之间,建立Sox9-Flp小鼠。将该品系小鼠与受Flp和Cre双酶调控的红色荧光蛋白Td Tomato（Td Tom）示踪小鼠Ai65D小鼠杂交,抽提鼠尾DNA,普通PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳,鉴定其基因型,获得双基因杂合小鼠即可用于示踪实验。2、Sox9-Flp/Ai65D小鼠肝脏中Td Tom的表达情况检测Sox9-Flp/Ai65D小鼠经尾静脉注射特异性作用于肝细胞的腺相关病毒AAV8-TBG-Cre后,将肝脏中表达过SOX9的肝细胞标记为红色荧光阳性。免疫荧光检测小鼠肝组织中Td Tom阳性细胞中肝细胞标志物肝细胞核因子4α（Hepatocyte nuclear factor 4 alpha,HNF4α）、胆管细胞标志物角蛋白19（Cytokeratin 19,CK19）及星状细胞标志物结蛋白（Desmin）的表达情况,并观察不同周龄（16周、32周和48周）小鼠体内荧光标记细胞数量。3、Sox9-Flp/Ai65D小鼠示踪肝癌细胞的起源AAV8-TBG-Cre处理Sox9-Flp/Ai65D小鼠,并按照上述STZ-HFD和DEN×1次的造模方式,诱导小鼠发生肝癌,检测肝癌细胞表达Td Tom的情况。三、肝脏特异性敲除SOX9在肝癌发生中的作用1、Sox9^LKO小鼠肝脏中SOX9表达情况的检测将Sox9^f/f小鼠与白蛋白驱动Cre重组酶表达的Alb-Cre小鼠杂交获得肝脏特异性敲除SOX9的Sox9^LKO小鼠。提取Sox9^f/f和Sox9^LKO两组小鼠肝脏组织蛋白,Western blotting检测肝脏组织中SOX9的表达量;免疫组化检测肝组织中SOX9的原位表达情况。2、观察肝脏特异性敲除SOX9对小鼠肝癌发生的影响选择对照组Sox9^f/f小鼠和肝脏特异性敲除SOX9的Sox9^LKO小鼠,按上述三种方式诱导小鼠发生肝癌。在不同时间点处死小鼠,观察小鼠肝癌发生率,肿瘤数量和肿瘤大小等。检测两组小鼠血清中肝功能指标,并对两组小鼠肝组织进行组织病理学分析。四、肝细胞特异性敲除SOX9在肝癌发生中的作用1、Sox9^HKO小鼠肝脏中SOX9的表达情况的检测腺相关病毒AAV8-TBG-Cre处理雄性Sox9^f/f小鼠后,特异性敲除肝细胞Sox9基因获得Sox9^HKO小鼠,对照病毒AAV8-TBG-Control处理的Sox9^f/f小鼠为对照小鼠。STZ-HFD造模后,分离小鼠原代肝细胞,提取m RNA和蛋白。RT-PCR和Western blotting检测两组小鼠SOX9的表达。2、肝细胞特异性敲除SOX9对肝癌发生的影响选择雄性Sox9^f/f小鼠经AAV8-TBG-Cre或AAV8-TBG处理后,获得Sox9^HKO小鼠和对照小鼠,以STZ-HFD和DEN×1次的方法诱导小鼠原发性肝癌。并在不同时间点处死小鼠,观察小鼠肝癌发生率,肿瘤大小、数量等。检测两组小鼠血清中肝功能指标,并对两组小鼠肝组织进行组织病理学分析。3、肝脏特异性敲除SOX9与肝细胞特异性敲除SOX9对肝癌发生作用的对比在STZ-HFD和DEN×1次两种肝癌模型中,对比Sox9^HKO小鼠和Sox9^LKO小鼠在同种肝癌模型中造模相同时间后,小鼠肝癌的发生情况。五、SOX9敲除后促进肝癌发生的机制研究1、RNA-seq检测SOX9基因敲除对肝癌发生过程中基因表达的影响DEN×25次模型中,Sox9^f/f组和Sox9^LKO组小鼠DEN注射13次后,抽提肝脏RNA,检测RNA质量,RT-PCR检测两组SOX9的表达,确定Sox9^LKO组SOX9表达下调后,委托生物公司测序分析,寻找SOX9敲除组与对照组差异表达的基因。2、根据RNA-seq分析结果,选择Wnt通路发生变化的基因,用测序样本的RNA对RNA-seq结果进行验证。3、进一步在STZ-HFD模型的Sox9^f/f和Sox9^HKO小鼠（高脂喂养8周）的原代肝细胞和肝组织RNA中验证上述Wnt通路变化的基因。4、Western blotting检测不同模型的Sox9^LKO小鼠和Sox9^HKO小鼠中,与肝癌发生相关的信号通路的变化。六、统计学分析服从正态分布的计量资料用X±SD表示,非正态分布的计量资料采用中位数（Q1,Q3）表示。若两组计量资料服从正态分布且方差齐性采用两独立样本t检验进行组间比较,若不服从正态分布或方差非齐性,则采用非参数检验进行两组间比较。数据运用SPSS 21.0软件进行统计分析,双侧P<0.05认为差异有统计学显著性。【实验结果】一、肝细胞表达SOX9不是肝癌发生的必要条件1、Sox9-Flp/Ai65D小鼠成功构建抽取Sox9-Flp/Ai65D小鼠的鼠尾基因组DNA行普通PCR,琼脂糖凝胶电泳观察突变条带,选择双基因阳性的即可作为示踪小鼠。2、Sox9-Flp/Ai65D小鼠注射AAV8-TBG-Cre后,表达过SOX9的肝细胞特异性表达Td Tom,并保持数量稳定（1）示踪小鼠肝组织中可见表达红色荧光的细胞,该细胞表达肝细胞特异性标志物HNF4α,但不表达胆管细胞标志物CK19和星状细胞标志物Desmin,表明Td Tom在表达过SOX9的肝细胞中特异性表达。（2）正常未造模的不同周龄（16w,32w,48w）小鼠有约10%的肝细胞为Td Tom+,且被标记细胞的数量不随小鼠周龄而变化。3、表达过SOX9的肝细胞不是肝癌细胞的唯一来源（1）STZ-HFD模型中,共有6只小鼠形成肿瘤,造模终点时可见小鼠肝脏变红,并可在肝脏表面见到“红色”和“白色”肿瘤。免疫荧光检测发现:肝脏中大量肝细胞表达Td Tom;6只小鼠切片中共观察到10个肿瘤,其中7个的肿瘤细胞为Td Tom+,其余3个的肿瘤细胞为Td Tom-,且Td Tom+和Td Tom-的肿瘤可见于同一肝脏中。（2）DEN模型中,亦可见小鼠肝脏变红,并有“红色”和“白色”肿瘤凸出于肝脏表面。免疫荧光检测发现:在5只小鼠肝脏切片中共观察到7个肿瘤。其中,2个为Td Tom-肿瘤,5个为Td Tom+肿瘤,且同一肝脏中也可见两种肿瘤。二、肝脏特异性敲除SOX9促进肝癌发生1、Sox9^LKO小鼠肝脏中胆管细胞和肝细胞中SOX9表达都显著减少Western blotting检测发现,Sox9^LKO组几乎无SOX9表达,而对照组小鼠肝脏中SOX9有表达。免疫组化染色可见,对照组小鼠肝组织中胆管细胞为SOX9阳性,并可在门静脉周围看到少量SOX9弱阳性表达的肝细胞,而Sox9^LKO组小鼠肝组织中罕见SOX9阳性的胆管细胞和肝细胞。2、肝脏特异性敲除SOX9促进小鼠发生肝癌（1）DEN×25次模型DEN注射13周（小鼠18周龄）时,两组小鼠均未见肝癌;DEN注射17周（小鼠22周龄）时,对照组无肿瘤发生,而Sox9^LKO组则有25%（1/4）可于显微镜下观察到肿瘤。DEN注射21周（小鼠26周龄）时,对照组小鼠有一只可见大体肿瘤,HE染色后可在显微镜下看到28.6%（2/7）小鼠发生肿瘤,Sox9^LKO组则100%（7/7）可观察到大体和显微镜下肿瘤。肝脏组织病理学检测:与对照组相比,Sox9^LKO组肝脏组织结构紊乱,汇管区细胞明显增生,并伴有明显的纤维化;免疫组化可见:Sox9^LKO组几乎无SOX9阳性细胞;Ki67阳性肝细胞增多;CK19染色可见胆管反应显著增强。小鼠血清肝功能指标检测:与对照组相比,Sox9^LKO组肝损伤指标ALT、AST、总胆红素都升高约2倍;胆汁淤积指标ALP和TBA也较对照组显著升高。（2）STZ-HFD模型高脂喂养4周（小鼠8周龄）时,两组小鼠均未发生肝癌;高脂喂养8周（小鼠12周龄）时,对照组小鼠在大体和显微镜下均未见肿瘤,而Sox9^LKO组中有66.7%（4/6）的小鼠大体可见凸出于肝脏表面的结节,83.3%（5/6）小鼠可在显微镜下观察到肿瘤。高脂喂养12周（小鼠16周龄）时,对照组33.3%（1/3）出现大体肿瘤,Sox9^LKO组100%（5/5）可见大体肿瘤。高脂喂养18周（小鼠22周龄）时,对照组仅66.7%（4/6）HE染色后可见到镜下肿瘤,Sox9^LKO组肿瘤发生率为100%。高脂喂养18周的两组小鼠肝组织病理学染色后发现:与对照组相比,Sox9^LKO组亦可见汇管区胆管增生;纤维化显著增强,胶原沉积不仅只存在于汇管区,也在肝实质中出现;CK19染色发现Sox9^LKO组胆管细胞明显增生,有较强的胆管反应。肝功能指标检测:与对照组小鼠相比,Sox9^LKO组小鼠血清转氨酶ALT、AST升高约2倍、总胆红素升高约3倍,总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）和甘油三脂（TG）也升高,胆汁淤积指标碱性磷酸酶（ALP）和总胆汁酸（TBA）分别升高约4倍和30倍。三、肝细胞特异性敲除SOX9促进肝癌发生1、Sox9^HKO小鼠肝细胞中SOX9显著减少RT-PCR及Western blotting检测STZ-HFD造模后的对照组和Sox9^HKO组原代肝细胞中SOX9的表达量,可见Sox9^HKO组SOX9表达较对照显著降低。2、肝细胞特异性敲除SOX9促进肝癌发生（1）STZ-HFD模型高脂喂养8周（小鼠12周龄）时,Sox9^f/f小鼠与Sox9^HKO组小鼠大体和显微镜下均未见肝癌,而83.3%（5/6）的Sox9^LKO组小鼠肝组织显微镜下可见肿瘤。高脂喂养12周（小鼠16周龄）,对照组25%（1/4）出现大体可见的肿瘤,Sox9^HKO组100%（5/5）可见肿瘤结节,Sox9^LKO组亦100.0%（6/6）可见肿瘤,且肿瘤的数量和直径较Sox9^HKO组更多,更大。病理学染色发现:Sox9^HKO组和Sox9^LKO组脂肪变程度较对照组更轻,Sox9^LKO组小鼠肝脏汇管区胆管细胞增生明显,且有显著的纤维化,而Sox9^f/f组和Sox9^HKO组则未见明显增生,亦无纤维化发生。CK19染色显示Sox9^f/f组和Sox9^HKO组无明显CK19阳性细胞增多和胆管反应,而Sox9^LKO组胆管细胞显著增多,汇管区胆管反应明显增强。分析各组小鼠血清肝功能指标发现:Sox9^HKO组与对照组相比,ALT、AST、Tbil、TBA、ALP都无明显差异,而Sox9^LKO组小鼠以上各项指标均较Sox9^HKO组和对照组升高。（2）DEN×1次模型DEN造模6个月时,Sox9^f/f小鼠与Sox9^HKO组大体均未见肝癌,而Sox9^HKO组有50.0%（1/2）HE染色后于显微镜下观察到肝癌。DEN造模8个月,对照组、Sox9^HKO组、Sox9^LKO组均可见大体肿瘤,其发生率分别为12.5%（1/8）、100%（5/5）和100%（7/7）。肝脏组织学分析可见到与STZ-HFD模型一致的结果。天狼猩红染色示Sox9^HKO组和Sox9^f/f组无明显纤维化,Sox9^LKO组汇管区出现轻度的纤维化。CK19染色显示Sox9^f/f组和Sox9^HKO组无明显胆管反应,而Sox9^LKO组胆管反应增加。与对照组相比,Sox9^HKO组各项肝功能指标无明显变化,而Sox9^LKO组则较Sox9^HKO组和对照组升高。3.胆管细胞SOX9缺失引起胆管反应和肝纤维化对肝癌发生具有促进作用Sox9^HKO组和Sox9^LKO组在STZ-HFD和DEN×1次两种模型中,可见造模至相同时间,Sox9^LKO组较Sox9^HKO组发生肿瘤更早,肿瘤更多,更大。组织病理学染色显示Sox9^LKO组较Sox9^HKO组出现显著的肝纤维化和胆管反应。四、SOX9敲除后促进肿瘤发生的机制可能与Wnt通路、AKT通路和ERK通路的活化相关。（1）利用RNA-Seq技术寻找造模后Sox9^f/f组和Sox9^LKO组差异表达的基因并进行分析后发现:SOX9敲除后的差异基因以表达上调的基因为主,KEGG分析发现Sox9^LKO组肿瘤相关信号通络基因表达上调,GSEA分析可见Wnt、Hedgehog、趋化因子和肿瘤相关信号通路活化。（2）RT-PCR法验证RNA-seq结果:检测所用测序样本（DEN×13次肝组织RNA）中Wnt通路上调基因:wnt5a、wnt7a、wnt7b、FZD2、FZD6等,RT-PCR结果与RNA-seq一致。（3）Wnt通路表达上调的基因,在STZ-HFD模型Sox9^HKO小鼠的原代肝细胞和肝组织RNA中的表达和对照组相比也明显上调。（4）Western blotting检测发现,不同的肝癌模型中,肝脏特异性敲除SOX9和肝细胞特异性敲除SOX9都可见p-AKT和p-ERK表达上调。【结论】1、肝细胞表达SOX9不是肝癌发生的必要条件。2、肝脏特异性敲除SOX9导致胆管反应和肝纤维化,促进HCC发生。3、肝细胞特异性敲除SOX9不会引起胆管反应和肝纤维化,但仍然促进HCC发生。4、胆管细胞缺失SOX9可能引起胆管反应和肝纤维化,促进HCC发生。5、敲除SOX9后,Wnt、AKT和ERK等通路活化,参与促进肝癌发生。SOX9在肝癌的发生和发展中可能起不同的作用。