目的：表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是临床应用较多的肿瘤分子靶向之一,包括纳米抗体(Nanobody)在内目前已发展了多种分子探针用于肿瘤EGFR的探测。Nanobody是最小的完整抗原结合片段,但其亲和力较低。为了改善其亲和力,我们将靶向EGFR Nanobody EG2分别与右臂卷曲螺旋(right-handed coiled-coil, RHCC)、人源性软骨寡聚基质蛋白(human cartilage oligomeric matrix protein, COMP)和C4b结合蛋白α链(C4b binding protein a-chain, C4bpa)等三种自相关肽进行融合,从而形成了三种不同的多价抗体即四聚体(EG2-RHCC)、五聚体(EG2-COMP)和七聚体(EG2-C4bpa)。本研究的目的是应用Tricarbonyl试剂盒并使用放射性核素99mTc标记Nanobody EG2及三种多价抗体(EG2-RHCC、EG2-COMP、 EG2-C4bpa),并在体内外检测四种标记复合物靶向识别EGFR的能力及其在体内的代谢特点。方法：将1ml新鲜高锝酸盐溶液注入Tricarbonyl试剂盒中,生成标记前体[99mTc(CO)3(OH2)3]+。取标记前体(400～500μ1)分别对Nanobody EG2(100μg,2mg/ml)、EG2-RHCC (100μg,1mg/ml)、EG2-COMP (100μg,2mg/ml)、EG2-C4bpa (100μg,1mg/ml)进行标记,并将标记物使用PD-10柱子进行纯化。使用EGFR高表达A431细胞和EGFR低表达OCM-1细胞在体外对99mTc-Nanobody EG2、99mTc-EG2-RHCC、99mTc-EG2-COMP和99mTc-EG2-C4bpa进行细胞结合、阻断、摄取和流出实验。分别将99mTc-Nanobody EG2、99mTc-EG2-RHCC、99mTc-EG2-COMP和99mTc-EG2-C4bpa注射入荷A431和OCM-1皮下移植肿瘤鼠内,并在不同时间点对其行单光子发射计算机断层(single photon emission computed tomography, SPECT)显像和生物分布研究。结果：四种标记物99mTc-EG2、99mTc-EG2-RHCC、99mTc-EG2-COMP和99mTc-EG2-C4bpa均被成功制备,标记率分别是60～71%、69～84%、78～80%和30～50%(n=3)。四种标记复合物在血清和磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)中的稳定性良好,至24h其放化纯均大于90%。体外细胞结合实验显示上述四种标记复合物均能与EGFR特异性结合。荷瘤鼠模型SPECT显像示99mTc-EG2在注射后3h肿瘤显影最为清晰(2.71±0.45%ID/g),相应肿瘤与血液比值(tumor/blood,T/B)为4.03±0.44,肿瘤与肌肉比值(tumor/muscle,T/M)为15.35±3.85,后随时间延长肿瘤显影逐渐变淡(6h:1.64±0.38%ID/g);99mTc-EG2-COMP在注射后3h即可见肿瘤显影,在6h时显影肿瘤显影最为清晰(6.96±1.23％ID/g,T/M=5.15±1.33),至24h仍可见肿瘤显影;99mTc-EG2-C4bpα在注射后2h即可见肿瘤显影至18h时仍可见肿瘤显影,A431肿瘤的摄取在10h达到最高(3.78±0.25%ID/g,T/M=3.69±0.48)；且在相应100μg过量未标记抗体与标记复合物共同注射的条件下肿瘤影像可被明显阻断。然而99mTC-EG2-RHCC在注射入EGFR高表达荷瘤鼠体内后各个检测时间点均未见肿瘤显影,且生物分布显示肿瘤的放射性摄取在各研究时间点均较低,如在6h的放射性摄取为2.05±0.2%ID/g。结论：本研究结果表明Nanobody作为一种小分子抗体具有良好的EGFR靶向能力,可在注射显像剂后短时间内快速成像,且可通过肾脏从体内快速清除。体内外研究证实EG2-COMP亦是一种具有良好EGFR靶向能力的抗体,作为一种中等分子量的多价抗体,未来其应用潜力较大,不仅可用于EGFR高表达肿瘤的诊断,亦有可能用于肿瘤的治疗。EG2-C4bpa相对于其他三种抗体来说,由于其分子量较大未来可能并不适合用于肿瘤的显像诊断,但我们的研究证实了其靶向EGFR的能力及特异性,为其应用于放射免疫治疗提供了依据。而EG2-RHCC虽然其在体外具有较高的结合力及特异性,但其体内结合特性仍有待进一步研究。总之,Nanobody及其多价抗体将在未来肿瘤的放射免疫显像与放射免疫治疗中有良好的应用前景并发挥越来越重要的作用。