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目的冷冻消融治疗中晚期前列腺癌疗效显著,可提高患者局部控制率及生活质量,已成为中晚期前列腺癌患者临床主要治疗手段,同时冷冻消融术后可诱导机体产生冷冻免疫反应,激活机体免疫系统,清除体内残余肿瘤细胞,有助于防止肿瘤的转移与复发。但是,冷冻免疫持续的时间及强度个体差异较大,同时体内也存在许多免疫负向调节的细胞因子及免疫细胞,不同程度地影响或制约冷冻免疫效果。如何有效控制负向免疫调节因素,最大化发挥冷冻免疫的效果成为该领域研究的热点。转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)是一种经典的、在人体分布广泛的细胞因子,可抑制多种免疫细胞的增殖与分化,具有较强免疫抑制作用。同时,髓源性抑制细胞(Myeloid derived suppressor cells,MDSCs)为一种具有较强负性免疫调节作用的细胞,其抑制活性受到TGF-β在内的多种细胞因子调节。目前,许多基础及临床研究结果已经证明,TGF-β阻断可以延缓肿瘤的进展,本课题组前期研究亦发现冷冻消融后TGF-β水平发生变化,推测TGF-β可能参与冷冻免疫调节,阻断TGF-β可能有助于改善冷冻免疫效果,亦有可能引起部分免疫调节细胞(如MDSCs)的变化。据此,我们推断,TGF-β单抗阻断与冷冻消融联合治疗可能增强冷冻免疫强度,并影响体内MDSCs变化,进而影响预后。据此,本研究采用细胞实验及动物实验,探究冷冻消融联合TGF-β单抗阻断治疗对小鼠前列腺癌的疗效及MDSCs的变化,为提高冷冻消融疗效提供新的理论依据。材料和方法1.细胞实验:将RM-1细胞分为四组:A组为对照组(对照组)。B组为单纯冷冻消融组(冷冻组)。C组为单纯TGF-β单抗阻断(抗体组)。D组为冷冻消融联合TGF-β单抗阻断组(联合组)。治疗后用ELISA检测细胞上清液中TGF-β含量,同时用Transwell及MTT检验不同治疗对细胞功能学影响。2.动物实验:构建小鼠前列腺癌移植瘤模型,分组同细胞学实验。小鼠腹股沟成瘤后,根据分组分别进行不同治疗,每隔三天测量肿瘤体积大小。另外,术后7天及14天处死小鼠,收集外周血、脾脏、肺组织、肿瘤组织标本。HE染色观察肺转移情况,流式细胞术检测脾脏淋巴细胞中MDSCs、CD4~+T、CD8~+T细胞以及骨髓中MDSCs的变化情况。LDH杀伤试验检测CTL细胞杀伤能力改变情况。ELISA检测各组小鼠血清中TGF-β及IL-10的变化情况。免疫组化染色观察肿瘤组织局部CD8~+T细胞及MDSCs变化情况。为观察肿瘤局部侵袭及转移能力改变情况,蛋白免疫印迹法(Western bolt)检测不同治疗后上皮间质转化相关蛋白N-cadherin,E-cadherin,Vimentin表达情况。结果:1.RM-1细胞经过冷冻联合TGF-β单抗阻断治疗后,细胞的增殖、迁移及侵袭能力明显减弱。另外,与对照组比较冷冻组,抗体组以及联合组三组细胞上清TGF-β含量减少。2.随时间推移,各组小鼠肿瘤体积逐渐增大。治疗后7天及14天,冷冻组、抗体组及联合组肿瘤体积均明显小于对照组。同时,与冷冻组及抗体组比较,联合组减瘤效果最明显(P<0.001)。另外,联合治疗组肺转移发生率以及肺转移灶数量明显小于其余三组。3.经过不同治疗后,与对照组比较,其余三组荷瘤小鼠血清TGF-β及IL-10含量呈明显降低趋势,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.随时间推移,对照组及抗体组小鼠脾脏MDSCs含量呈逐渐升高趋势,而冷冻组与联合组脾脏MDSCs含量逐渐下降。治疗后7天及14天:冷冻组、抗体组及联合组小鼠脾脏MDSCs含量均低于对照组,仅冷冻组及联合组与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。5.随时间推移,对照组小鼠骨髓MDSCs呈逐渐上升趋势,冷冻组及联合组呈逐渐下降趋势,抗体组成先下降后上升趋势。另外,其余三组小鼠脾脏MDSCs含量明显小于对照组。同时,联合组骨髓MDSCs含量低于冷冻组及抗体组,但仅与抗体组比较具有统计学差异(P=0.001、P=0.630)。6.随时间推移,联合组肿瘤组织中MDSCs含量呈逐渐降低趋势。与其他组比较MDSCs含量明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.随时间推移,对照组小鼠脾脏中CD4~+T及CD8~+T细胞含量逐渐减少,而冷冻组、抗体组及联合组呈上升趋势;与其他三组比较,联合组小鼠脾脏中CD4~+T及CD8~+T细胞在7天、14天均显著增加(P<0.05)。8.随时间推移,对照组CTL细胞杀伤活性呈下降趋势,而冷冻组、抗体组及联合组逐渐上升;与其他三组比较,联合组在7天、14天CTL细胞杀伤活性均显著增加(P<0.05)。9.冷冻消融联合TGF-β单抗阻断治疗可以抑制RM-1细胞EMT的发生。Western bolt检测相关蛋白,联合组N-cadherin,Vimentin等间质标志物表达比较对照组明显减弱,而上皮标志E-cadherin表达增加。10.骨髓、脾脏以及肿瘤局部MDSCs数量与外周血TGF-β分泌水平呈正相关(P<0.001)。同时,肿瘤局部MDSCs数量与浸润CD8~+T细胞数量呈负相关(P<0.001),与外周血IL-10水平呈正相关(P<0.001)。结论:1.体外细胞实验证明冷冻消融联合TGF-β单抗阻断可以明显减弱RM-1前列腺癌细胞增殖,迁移及侵袭能力。2.动物实验显示冷冻消融联合TGF-β单抗阻断可以明显减小荷瘤小鼠肿瘤负荷,减少肺转移发生率及肺转移数量,同时降低外周血TGF-β及IL-10含量。3.冷冻消融联合TGF-β单抗阻断后,荷瘤小鼠骨髓、脾脏及肿瘤组织中MDSCs含量明显减少,且与外周血TGF-β含量呈正相关。同时,联合治疗可使脾脏中CD4~+T及CD8~+T细胞以及肿瘤局部CD8~+T细胞含量明显升高,提高CTL细胞杀伤能力,增强机体免疫能力。