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本项研究的目的是比较光动力疗法对Hela细胞和耐紫杉醇的Hela/Taxol细胞的杀伤作用,以探讨光动力疗法治疗宫颈癌和耐化疗药物的宫颈癌是否有疗效。一、人宫颈癌耐紫杉醇Hela/Taxol细胞系的建立及其耐药性的研究方法:①人宫颈癌Hela细胞作为亲代细胞,在培养基中加入紫杉醇,通过逐步递增法筛选出其耐药Hela/Taxol细胞。②观察Hela和Hela/Taxol细胞的细胞形态和生长趋势,分别绘制生长曲线。③MTT法检测不同化疗药物对于Hela和Hela/Taxol细胞的半数抑制浓度(IC50)。④RT-PCR法检测Hela和Hela/Taxol细胞中多药耐药基因P-gp、GST-π和凋亡相关基因Bcl-2、Survivin的表达。⑤免疫荧光法和蛋白质印记法检测Hela和Hela/Taxol细胞中Bcl-2、P-gp、GST-π、Survivin蛋白的表达。结果:与Hela细胞相比,Hela/Taxol细胞具有以下特点:①生长缓慢;②在不同化疗药物作用下,Hela/Taxol的IC50值均有明显的增加,对紫杉醇的耐药性最强,对5-FU的耐药性最差。结果表明Hela/Taxol细胞具有更强的耐药性。③耐药基因P-gp和GST-π的基因和蛋白的表达均增加;④抗凋亡基因Bcl-2和凋亡抑制基因survivin的基因和蛋白表达也增加。二、光动力疗法对Hela细胞和Hela/Taxol细胞的杀伤作用的研究方法:1、实验分组:Hela和Hela/Taxol两种细胞分别设有空白对照组、单纯光敏剂组、单纯光照组、光敏剂+光照治疗组。2、MTT法检测光动力疗法对Hela和Hela/Taxol两种细胞株的抑制作用,并筛选ALA浓度和光照能量的最佳组合参数。3、MTT法比较光动力疗法对Hela和Hela/Taxol细胞的半数抑制浓度差异。4、采用流式细胞仪检测Hela和Hela/Taxol细胞接受光动力作用前后细胞凋亡的影响。5、免疫荧光法检测光动力疗法作用前后两种细胞中P-gp、GST-π、Bcl-2和Survivin蛋白表达的差异。6、裸鼠成瘤实验。结果:1、Hela/Taxol细胞比Hela细胞对光动力疗法更敏感。2、ALA浓度lmmol/L、光照能量5J/cm2为光动力疗法体外杀伤Hela和Hela/Taxol细胞较理想的实验条件。3、光动力疗法可显著诱导Hela和Hela/Taxol细胞凋亡,并抑制细胞中 P-gp、GST-π、Bcl-2 和 Survivin 的蛋白表达。4、Hela-PDT 和 Hela/Taxol-PDT组的细胞均出现细胞凋亡率显著增加。5、裸鼠成瘤实验结果显示:Hela-PDT和Hela/Taxol-PDT组细胞形成的瘤体比Hela和Hela/Taxol细胞形成的瘤体,生长缓慢,最后形成的肿瘤体积小、重量轻。所以光动力疗法可以抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,且对Hela/Taxol细胞形成的瘤体抑制作用更明显。结论:光动力疗法在体外对Hela和Hela/Taxol细胞均有明显抑制增殖,促进凋亡的作用,其中Hela/Taxol比Hela细胞对光动力疗法更敏感,其机理可能与抑制P-gp、GST-π、Bcl-2和survivin的蛋白表达有关。创新点:1、培养出了耐紫杉醇的Hela/Taxol细胞株,并且验证了其耐药性,为今后研究耐药性肿瘤提供重要的研究载体。2、虽然Hela/Taxol细胞存在耐药性,但是当光动力疗法作用于两种细胞时,对Hela/Taxol细胞的抑制率比Hela细胞更高,杀伤作用更明显。