sCTLA-4联合sFasL诱导小鼠皮肤移植免疫耐受及CTLA-4-FasL膜镶嵌表达载体的构建

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CTLA-4是表达于活化T细胞表面的共刺激信号抑制配体,与抗原递呈过程中T细胞活化的负调控有关;FasL属于肿瘤坏死因子家族,能传导细胞凋亡信号,诱导活化的T细胞凋亡;白介素-10(IL-10)和转化生长因子β(TGF-β)都是体内具有免疫抑制功能的分子。 第一部分探讨了sCTLA-4联合sFasL、IL-10、TGF-B诱导小鼠皮肤移植免疫耐受的作用及机制。以C57BI./6小鼠为供体,BALB/c小鼠为受体进行皮肤移植,分7个组。移植完后进行肌肉注射给药并观察皮肤的存活状况:用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中IL-2、IL-4和FN-T的含量;取实验鼠、相应供体鼠及实验不相关ICR鼠的脾脏淋巴细胞,进行双向混合淋巴细胞培养,以MTr法测刺激指数。实验结果为:NS组皮肤平均存活时间为6.9d,而ITCF组皮肤平均存活时间最长,达22.5d:C组的皮肤平均存活时间为19.2d,和CsA组(15.7d)相比能差异显著性延长皮肤存活时间;CF组的皮肤平均存活时间比C和F组分别延长2.5d和5.7d;ITCF组与CF组相比存活时间无显著异性,但与IT组相比具有差异极显著性;各给药组与对照组相比血清中IL-2和IFN-y含量显著降低,IL-4含量显著升高。以上结果可以显示本实验室基因工程表达的sFasL和sCTLA-4在体内具有较强的诱导免疫耐受的生物活性:sCTLA-4、sFasL单用或两者联用都能延长移植皮肤的存活时间,并且联用具有协同效应;单独使用以sCTLA-4效果最佳,并且优于临床上常用免疫抑制药物CsA;在sCTLA-4、sFasL联用的基础上应用IL-10、TGF-B,叠加效应不明显;sCTLA-4和sFasL诱导的皮肤移植免疫耐受具有抗原特异性;血清中细胞因子IL-2和IFN-γ含量与移植物存活时间呈负相关,而IL-4呈正相关;本研究工作为寻找免疫耐受诱导途径、指导临床用药以及预测受体耐受状况和移植物存活时间提供一定实验和理论依据。 第二部分内容是将CTLA-4和FasL的胞外区及跨膜区序列体外拼接在一起并克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV形成pAdTrack-CMV-CF质粒,同时构建了另外3个质粒:单独含有FasL胞外区及跨膜区的质粒pAdTrack-CMV-F;同时干扰B71、B7.2的siRNA干扰质粒pAdTrack-CMV-U6B7si;同时表达CTLA-4和FasL及干扰B7.1、B7.2的质粒pAdTrack-CMV-CFU687si。将以上4个质粒分别与腺病毒骨架载体pAdeasy-1在BJ5183菌株里面进行重组得到腺病毒重组质粒pAd-CF、pAd-F、pAd-U6BTSi、pAd-CFU6BTSi。期望这些质粒转染293细胞后制备的腺病毒感染靶细胞(如DC)后能使CTLA-4和FasL或FasL膜镶嵌表达于靶细胞上,并可以下调其B7.1和B7.2的表达。这为以后免疫耐受理论的研究甚至器官移植排斥反应和自身免疫病的基因治疗提供了新的思路和方法,并奠定了研究基础。
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